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- 基于COL1A1启动子和增强型绿色荧光蛋白基因建立人肝星状细胞活化的细胞模型
- 2023年
- 目的:建立评价人肝星状细胞中Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1肽链(collagen Iα1 chain,COL1A1)基因启动子活性的可视化报告系统,判断细胞的活化状态,为抗肝纤维化药物的研究提供细胞模型。方法:以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,扩增COL1A1启动子序列。在pLVX-AcGFP1-N1质粒基础上构建以COL1A1启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达的重组质粒pLVX-COL1A1-EGFP。使用慢病毒包装系统将pLVX-COL1A1-EGFP稳定转染至永生化的人肝星状细胞LX-2中,并筛选单克隆细胞株。对该细胞株使用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)激活及2种具有潜在抗肝纤维化作用的药物处理。使用荧光显微镜及ImageJ 1.49软件对细胞中EGFP荧光强度进行半定量分析,再分别使用逆转录实时定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫印迹试验检测胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平。结果:构建了由COL1A1启动子调控EGFP表达的重组慢病毒质粒pLVX-COL1A1-EGFP,并加入了Kozak序列以增强EGFP的表达,获得了稳定转染pLVX-COL1A1-EGFP的LX-2单克隆细胞株LX-2-CE。LX-2-CE经过TGF-β1和具有潜在抗肝纤维化作用的5μmol/L二氢丹参酮Ⅰ共处理24 h后,其总荧光强度和平均荧光强度均低于TGF-β1单处理组(P<0.05);胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平同样均低于TGF-β1单处理组(P<0.05)。结论:成功构建了基于COL1A1启动子调控EGFP表达的肝星状细胞活化的报告系统,可在体外直观报告肝星状细胞活化相关标志物COL1A1表达,为抗肝纤维化药物的筛选和研究提供了新的细胞模型。
- 王磊金香淑董慧君欧国敏赖鑫源庄辉李彤向宽辉
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白
- 动物科学专业《细胞分子生物学》实验课程教学改革实践——以绿色荧光蛋白基因表达实验为例
- 2023年
- 为提升细胞分子生物学实验课程的教学效果,贵州大学动物科学专业以开设的绿色荧光蛋白基因表达的综合性实验为例,从实验方案的设计与实施、实验课程教学改革效果、存在的问题与解决方法等方面展开分析,发现了连续性主题实验在加强学生实践操作和动手能力、培养学生科研思维、发现并解决问题及提高学生实践创新能力中的重要作用。同时,实验课程教学综合运用启发式和讨论式教学方法,达到了教学相长的良好效果,为细胞分子生物学实验课程的教学改革提供了较好的参考。
- 段志强赵佳福张依裕李辉陈祥
- 关键词：动物科学细胞分子生物学实验课程
- 猕猴桃间座壳菌Diaporthe actinidiae的绿色荧光蛋白基因标记及侵染过程被引量：1
- 2022年
- 果实软腐病是猕猴桃贮藏期间最严重的真菌病害,猕猴桃间座壳Diaporthe actinidiae是该病检出率最高且致病力最强的病原菌。该病菌从花前期开始侵染,至果实贮藏期才表现症状,侵染至发病周期较长,可借助荧光标记对其侵染过程进行研究。本研究采用PEG介导原生质体转化的技术,运用携带GFP及潮霉素抗性基因的双元载体pCAMBgfp对D.actinidiae菌株进行遗传转化。首先,对转化子进行潮霉素及绿色荧光筛选,随后进行菌落的生物学特征观察、荧光稳定性验证及致病力检测,最终得到3株菌丝形态、生长速度及致病力与野生型菌株一致的稳定荧光菌株。将KFDA-17转化子接种于贮藏期猕猴桃果实‘金梅’,1 d后果实出现水渍症状,随后出现软腐症状且逐步加重;发病部分菌丝体在荧光显微镜下呈现明显的绿色荧光,可清晰观察侵染进程。本研究成功构建了PEG介导的间座壳菌丝体的原生质体遗传转化体系,且KFDA-17荧光菌株可用于侵染过程研究。
- 冯丹丹邓蕾苏琦雅刘德江钟彩虹李黎
- 关键词：荧光蛋白转化子致病力
- 一种鲍曼不动杆菌的绿色荧光蛋白基因标记方法
- 本发明提出了一种绿色荧光蛋白基因标记鲍曼不动杆菌的方法，构建了pET‑RA‑Y大肠杆菌‑鲍曼不动杆菌穿梭质粒(包含启动子序列、GFP序列、鲍曼不动杆菌基因复制起始点序列、利福平抗性筛选标记)，并导入到鲍曼不动杆菌标准菌株...
- 余道军潘平
- 文献传递
- 慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白基因标记大鼠脂肪干细胞及体内示踪初步研究
- 目的：通过EGFP慢病毒感染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)进行标记，经局部皮下注射移植入同种异体正常大鼠体内，利用荧光显微镜及免疫组化检测移植细胞在大鼠体内的分布、迁移和定居情况，评价EGFP慢病毒对大鼠脂肪干细胞的标记及...
- 张瑶瑶
- 关键词：脂肪干细胞基因标记增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体
- 腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究被引量：1
- 2020年
- 目的比较四种不同血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast,GSF)的转染效率及安全性,筛选合适的基因转染载体。方法原代分离培养GSF并鉴定,利用AAV2、AAV5、AAV8、AAV9介导EGFP基因并按不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)10、100、1000、10000转染GSF,空白对照组加入空白培养基,转染后2 d、3 d、4 d、5 d荧光显微镜下观察GFP表达强度及细胞生长状态,流式细胞术检测细胞转染率及凋亡率,CCK-8法检测细胞活力。结果AAV感染GSF后2 d各组均可见弱荧光,荧光强度随时间延长及MOI值增大而增强,而AAV9-EGFP组全程弱荧光,空白对照组全程无荧光。转染后5 d,MOI=10000时各组荧光最强,基因转染率组间整体比较,差异具有统计学意义(P<0.05);组间两两比较,AAV8-EGFP组均高于其他各组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。各组Annexin V阳性凋亡率与空白对照组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。各组在450 nm波长处光密度值与空白对照组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论AAV8能有效地转染GSF,且对细胞凋亡、细胞活力无明显影响,是安全可行的。
- 鲍庆东刘太祥罗鑫田祥
- 关键词：腺相关病毒增强型绿色荧光蛋白豚鼠巩膜成纤维细胞基因转染
- 绿色荧光蛋白基因克隆及其表达培养基的筛选
- 2020年
- 为应用PET15b-GFP观察细胞内部结构等功能奠定基础,研究绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的基因克隆及其在不同种培养基条件下不同种感受态大肠杆菌细胞中的表达状况,通过克隆提纯PET15b-GFP质粒,将已插入单链抗体3E3和152的重组质粒pET15b-3E3-GFP和pET15b-152-GFP,运用转化的方法将重组质粒分别导入感受态的大肠杆菌细胞中(BL21,B cell,K12),在不同培养条件下使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GFP基因进行表达,筛选出表达最好的并改良表达能力最弱表达条件。结果表明:重组质粒pET15b-152GFP-BL21在液态LB培养基中30℃、0.4mmol/L IPTG、180r/min诱导条件下培养显色最显著,在固态富集酵母培养基中30℃,1mmol/L诱导条件下培养显色最显著;表达能力最弱的重组质粒pET15b-152-GFP-B cell在富集酵母液体培养基中25℃、180r/min、0.4mmol/L IPTG的条件下诱导培养表达绿色荧光最显著;pET15b-152-GFP-B cell在0 mmol/L、0.1mmol/L、0.4mmol/L和1mmol/L IPTG的诱导条件下表达绿色荧光无显著差异。
- 张雯龙欢欢
- 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆培养基
- 腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究
- 目的：比较四种血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞（g...
- 鲍庆东
- 关键词：巩膜成纤维细胞增强型绿色荧光蛋白
- 文献传递
- 苦瓜枯萎病原菌的绿色荧光蛋白基因标记被引量：1
- 2020年
- 【目的】苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momodicae)侵染引起的一种重要土传病害。为有效防控该病害,对其病原菌进行绿色荧光蛋白基因(gfp)标记,为研究病原菌在苦瓜植株体内的侵染特性提供可视化跟踪检测手段。【方法】采用农杆菌介导的遗传转化方法对苦瓜枯萎病原菌强致病性野生型菌株FJAT-3018进行绿色荧光蛋白基因(gfp)标记,通过对转化子的菌落形态观察、生长速率和致病性测定,筛选出遗传稳定的转化子。【结果】野生型菌株FJAT-3018的转化效率约为14.5个转化子/10^6个孢子。经10次继代培养,筛选获得的转化子在菌落形态、生长速率和致病性方面与野生型菌株FJAT-3018无明显差异,gfp基因在转化子的菌丝体和分生孢子中均能强表达;通过激光共聚焦显微镜扫描跟踪发现,转化子能够在苦瓜植株根部和茎部侵染与定殖。【结论】绿色荧光蛋白基因已成功转入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中,其转化子具有良好的遗传稳定性且致病力不受影响。
- 陈燕萍刘欣肖荣凤朱育菁林永胜刘波
- 关键词：苦瓜枯萎病绿色荧光蛋白基因标记
- 携带绿色荧光蛋白基因重组猫泛白细胞减少症病毒的拯救
- 2020年
- 本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPV),以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的GFP基因,并对pFPV质粒进行定点突变,从而获得AgeⅠ和NheⅠ酶切位点,然后用AgeⅠ和NheⅠ同时双酶切pFPV和GFP基因,经4℃过夜连接、转化,成功构建携带GFP基因的重组猫泛白细胞减少症病毒质粒pFPV-GFP,应用脂质体转染法将重组质粒pFPV-GFP导入猫肾细胞(F81),利用GFP独特的发光机制可在荧光显微镜下对标记的重组病毒rFPV-GFP进行细胞内活体观察,利用Western blotting鉴定重组病毒rFPV-GFP中GFP的表达情况。结果显示,重组质粒pFPV-GFP转染F81细胞24 h时可观察到绿色荧光蛋白,且随着转染时间的延长观察到的绿色荧光蛋白数量增多,说明重组质粒pFPV-GFP成功转染到F81细胞中,Western blotting鉴定出GFP在重组病毒rFPV-GFP中稳定表达。本研究通过在pFPV上成功插入GFP并拯救出病毒,说明pFPV上可以插入外源基因,为其他外源基因在pFPV上的插入奠定基础,同时GFP的插入为FPV的研究提供了更加有利的研究工具,为FPV的基础研究以及中和抗体的快速检测奠定基础。
- 殷娟斌周亚花殷相平张志东
- 关键词：重组病毒拯救
