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重叠 延伸 PCR 生成长重复DNA序列及其在纳米孔测序中的应用2024年 PCR ,实现了短链DNA的重叠 延伸 ,最终生成长串联重复序列,其产物长度为原始长度的5~20倍。生成的长链DNA可直接测序,仅需对齐单个或少数几个Reads进行简单分析即可获得精确的序列信息。本研究所开发的重叠 延伸 法将纳米孔One read精确度提高至99.28%,这对提高纳米孔测序的精度具有重要作用。基于平行模板的重叠 延伸 PCR 优化策略 2023年 重叠 延伸 PCR 是传统基因定点突变的简化方案,其瑕疵是不完全延伸 片段交叉互补会产生野生型干扰。为寻找原方案下形成交叉互补的关键因素,提高其定点突变效率,对诸多相关因素进行了分析。发现调整中介引物浓度稀释比可以增加目标突变体含量,但难以彻底消除野生型干扰;而基因长度则明显影响终产物构成。据此提出两步法重叠 延伸 PCR 优化策略,先分别在两个小管中扩增突变位点上、下游片段,再直接混合继续PCR 扩增目标基因突变体。以克隆细胞周期蛋白E的定点突变为例进行验证,得到90%阳性率。优化的两步法重叠 延伸 PCR 方案既保持了相对简化的操作步骤,又明显提高了突变效率,是对传统重叠 延伸 PCR 定点突变技术的重要改进。关键词：定点突变 基于重叠 延伸 PCR 的抗结核药物耐药性检测方法 重叠 延伸 PCR 的抗结核药物耐药性检测方法，采用重叠 延伸 PCR 法，在单管中将rpoB、embB、katG基因和inhA启动子的四个耐药相关片段连接扩增为一个约700bp长的融合片段，并只需一次测序反应得到...一种新的基于重叠 延伸 PCR 的载体构建方法以及试剂盒 重叠 延伸 PCR 的载体构建方法：(1)根据目的基因和目的载体的序列设计第一轮PCR 扩增引物对，上游引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之前的20～35bp同源臂序列，3’端部分为目的基因扩增特...一种改进的重叠 延伸 PCR 方法 重叠 延伸 PCR 方法，本发明通过添加引物，在重叠 延伸 PCR 过程中能利用引物进行指数扩增，有效提高克隆效率和插入片段的长度，如实施例1所示，传统方法无法获得目的克隆，而本发明方法克隆数提高约10倍的同时...文献传递 重叠 延伸 PCR 技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化被引量：2 2022年 重叠 延伸 PCR (SOE PCR )技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE PCR 技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n)进行第1步PCR 扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR 退火延伸 对产物1和产物2进行重叠 拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR 扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E.coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果:第1步PCR 扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR 退火延伸 和第3步PCR 扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT)。在0.5 mmol·L^(-1)IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。结论:利用SOE PCR 技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。关键词：重叠延伸PCR 定点突变 融合蛋白 丝氨酸 丙氨酸 重叠 延伸 PCR -酶切连接法构建链霉菌表达载体被引量：1 2021年 重叠 延伸 PCR 与双酶切结合的连接方法,构建链霉菌表达载体,以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)基因组DNA为模板,扩增红霉素合成相关的甲基化酶基因(erythromycin O-methyltransferase,eryG)和羟基化酶基因(erythromycin C-12 hydroxylase,eryK),以及启动子permE基因,采用重叠 延伸 PCR 及EcoRⅤ、NotⅠ和XbaⅠ酶切位点相结合的连接方法构建含有多个基因片段的链霉菌重组表达载体。成功构建了携带外源基因的表达载体pSET001、pSET002和pSET003,最终获得含有多个基因的重组质粒。双酶切载体构建时载体或DNA片段上可用的限制性酶切位点受到限制,通过结合重叠 延伸 PCR 技术,可以利用较少的内切酶快速构建含有多个基因片段的重组载体,为红霉素生产菌的改造提供了重组载体。关键词：重叠延伸PCR 酶切 一种新的基于重叠 延伸 PCR 的载体构建方法以及试剂盒 重叠 延伸 PCR 的载体构建方法：(1)根据目的基因和目的载体的序列设计第一轮PCR 扩增引物对，上游引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之前的20～35bp同源臂序列，3’端部分为目的基因扩增特...文献传递 重叠 延伸 PCR 技术在单碱基定点突变中的作用被引量：2 2021年 重叠 延伸 PCR 技术对氨基酸通透酶基因进行单碱基定点突变,以便为今后研究植物对外源氮的吸收与利用率奠定基础。本研究根据Tair数据库中拟南芥AtAAP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计含有1个突变位点的2对互补的定点突变引物和1对带有pCAMBIA3301-GFP载体的多克隆位点的接头引物,以野生型拟南芥叶片的cDNA为模板,进行3次PCR 扩增,将获得的突变基因片段连接到pCAMBIA3301-GFP载体上,转化DH5α感受态细胞。将筛选的阳性菌株送至公司测序,测序结果表明拟南芥AtAAP1基因的第908位碱基A突变为T,实现了单碱基定点突变,这与预计结果相同,说明成功依靠重叠 延伸 PCR 技术做到目的基因的定点突变。该技术能方便快速地获得定点突变序列,为进一步研究AtAAP1基因的功能奠定了基础。关键词：定点突变 2种重叠 延伸 PCR 技术构建5种立克次体融合基因的方法学比较 被引量：1 2020年 重叠 延伸 PCR (SOE-PCR )技术将5种立克次体目的基因片段进行融合,同时对2种方法进行比较。方法采用一步法及两步法融合基因技术,对5种立克次体融合基因进行构建,并优化一步法中重叠 引物浓度以及两步法中各靶基因产物加入量,以提高2种方法的融合效率。结果成功建立5种立克次体融合基因。一步法基因融合过程中重叠 引物浓度在0.1~0.01μmol/L时,912 bp的融合基因条带亮度较高,且杂带较少;两步法基因融合过程中各靶基因产物加入量为0.1~0.25μL时,912 bp的融合基因条带亮度较高,且杂带较少。结论一步法基因融合技术操作简单、耗时短且耗材少,在掌控好退火时的温度及时间的情况下是一种经济、方便且高效的融合技术。为后续进行立克次体融合基因表达载体构建以及立克次体分子生物学多重检测提供实验模板。关键词：融合基因 一步法 两步法
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