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GOPC对猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖的影响: 2025年; 旨在探究高尔基体支架蛋白GOPC对猪瘟病毒(CSFV)增殖的影响,为其在CSFV增殖过程中的作用和分子机制研究奠定基础。设计合成3条靶向猪GOPC基因的siRNA,验证对GOPC mRNA的干扰效率。以高效siRNA序列为基础,干扰GOPC在PK-15细胞表达,接毒后检测GOPC敲低情况下CSFV的增殖状况。同时用RT-qPCR和Western blot分析CSFV感染后PK-15细胞中GOPC的表达情况。结果表明,GOPC敲低的PK-15细胞中CSFV基因组拷贝数显著上升,IFA也检测到GOPC敲低后CSFV E2蛋白表达量显著增高。在CSFV感染PK-15细胞后,随着病毒感染时间的延长,宿主细胞GOPC的表达量出现了下调趋势,但在感染后24 h出现短暂上调。因此,从上述结果可以初步推断GOPC蛋白抑制CSFV的增殖复制,而CSFV则可以通过调节细胞GOPC蛋白表达从而促进自身增殖。; 何俊瑶宋梦昭纪甜甜罗燕邓文; 关键词：猪瘟病毒病毒增殖

猪源SIRT5促进O型口蹄疫病毒在PK-15细胞复制: 2024年; 目的探究猪源SIRT5对O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus serotype O,FMDV-O)复制的影响及其调控FMDV-O复制的初步机制。方法利用Western Blotting和RT-qPCR检测FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5表达情况;设计合成3对SIRT5特异性siRNA,通过Western Blotting和RT-qPCR检测SIRT5、FMDV-O蛋白水平、转录水平及病毒拷贝数的变化情况;构建SIRT5真核表达质粒转染至PK-15细胞,运用Western Blotting、RT-qPCR实验方法探究过表达SIRT5对FMDV-O复制的影响,同时利用RT-qPCR检测过表达SIRT5对SeV、FMDV-O诱导的I型干扰素刺激基因mRNA表达水平的影响。结果FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5的表达上调;siRNA干扰SIRT5抑制FMDV-O的复制;过表达SIRT5促进FMDV-O复制;过表达SIRT5降低了SeV、FMDV-O诱导的干扰素刺激基因mRNA的表达水平。结论FMDV-O感染刺激宿主SIRT5表达,而猪源SIRT5通过抑制I型干扰素刺激基因的产生进而促进FMDV-O复制。本研究为进一步探究猪源SIRT5促进FMDV-O复制的机制提供参考依据。; 陈国辉史喜绢别鑫恬杨行赵思越张大俊赵登率闫文倩陈玲玲赵美玉何路郑海学刘霞张克山; 关键词：PK-15细胞

白术多糖对Cr(Ⅵ)诱导PK-15细胞凋亡和小鼠肾损伤的影响被引量：3: 2024年; 为探讨白术多糖(RAMPS_(t))对Cr(Ⅵ)致PK-15细胞凋亡和小鼠肾损伤的保护作用,为临床中药多糖缓解重金属中毒导致肾损伤提供理论依据。采用RAMPS_(t)干预Cr(Ⅵ)所致PK-15细胞损伤,检测细胞存活率、ROS水平、线粒体膜电位、细胞凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表达水平,测定MDA、SOD和GSH含量。为了进一步验证RAMPS_(t)对Cr(Ⅵ)致小鼠肾氧化应激及凋亡的保护作用,检测肾组织中ROS、MDA、SOD、GSH的变化及Bcl-2、Bax的表达水平。结果显示,RAMPS_(t)缓解Cr(Ⅵ)引起细胞内ROS水平升高,线粒体膜电位下降,MDA水平升高及SOD、GSH水平降低,且减少细胞凋亡率。同时,RAMPS_(t)增强Bcl-2蛋白表达水平,降低Bax蛋白表达水平。RAMPS_(t)干预可抑制Cr(Ⅵ)致小鼠ROS、MDA水平升高和SOD、GSH水平下降;并且降低Bax蛋白表达水平,增加Bcl-2蛋白的表达水平,减轻Cr(Ⅵ)诱导的小鼠肾脏细胞凋亡。因此,RAMPS_(t)通过降低ROS水平,阻断氧化应激介导的线粒体凋亡途径,从而拮抗Cr(Ⅵ)致PK-15细胞和小鼠肾氧化应激及凋亡的作用。; 吕昌洋范汝鹏赵茜曼高忆凡蒋猛林李林珏郑丕苗刘建柱赵晓娜; 关键词：白术多糖氧化应激细胞凋亡 PK-15细胞

猪源G3BP1基因的稳定敲低PK-15细胞系构建及生物信息学分析被引量：1: 2024年; 【背景】Ras-GTP酶活化蛋白SH3结构域结合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein 1,G3BP1)是应激颗粒(stress granule,SG)的重要组成部分和标志性蛋白,在宿主抵抗病原体入侵过程中发挥重要作用。【目的】构建G3BP1稳定敲低的PK-15细胞系,探究敲低G3BP1基因对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、塞内卡病毒(seneca virus,SVV)和痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)复制的影响和对肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、抗黏病毒蛋白1(myxovirus resistance protein 1,Mx1)、干扰素刺激基因54(IFN-stimulated gene 54,ISG54)和干扰素β(interferonβ,IFN-β)表达的影响,并对该基因进行生物信息学分析。【方法】利用慢病毒载体构建稳定敲低G3BP1基因的PK-15细胞系,利用逆转录实时定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析敲低G3BP1基因对VSV、SVV和VACV复制的影响,利用RT-qPCR分析感染VSV、SVV和VACV后敲低G3BP1基因对TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的影响,通过在线工具对G3BP1基因进行生物信息学分析。【结果】RT-qPCR和免疫印迹(Western blotting,WB)结果显示成功构建稳定敲低G3BP1的PK-15细胞系;RT-qPCR和qPCR结果显示敲低G3BP1基因可极显著促进VSV和SVV的复制(P<0.0001),但对VACV的复制无显著影响(P>0.05);RT-qPCR结果显示VSV和SVV感染可显著或极显著促进TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的mRNA表达水平(P<0.05,P<0.0001),敲低G3BP1基因可极显著抑制上述细胞因子的mRNA表达(P<0.01,P<0.0001),RT-qPCR结果显示VACV感染可以极显著抑制上述细胞因子的mRNA表达(P<0.01,P<0.0001),敲低G3BP1基因对VACV抑制的细胞因子mRNA表达无显著影响(P>0.05);理化性质预测结果显示,猪源G3BP1蛋白存在30个磷酸化位点,具有不稳定性和亲水性,属于非跨膜和非分泌蛋白;蛋白质高级结构预测�; 林馨倩郭紫晶张瑞向晗一林含睿黄雄挺陈劲松张志东李彦敏; 关键词：PK-15细胞

镉通过Nrf2/HO-1通路诱导猪肾PK-15细胞铁死亡: 2024年; 镉(Cd)是非必需且难降解的重金属元素之一,镉蓄积可导致肾损伤。本研究旨在揭示镉暴露诱导猪肾PK-15细胞铁死亡的作用机制。首先,CCK-8法检测梯度浓度氯化镉(CdCl_(2))对PK-15细胞活力的影响,以筛选出合适的工作浓度。其次,用10μmol/L CdCl_(2)处理PK-15细胞3、6和12 h,通过比色法检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)和细胞中丙二醛(MDA)的含量,Western blot检测铁死亡相关蛋白的表达水平,荧光探针法检测细胞中亚铁离子(Fe^(2+))含量。最后,用10μmol/L的HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP)预处理PK-15细胞6 h,再用10μmol/L CdCl_(2)处理PK-15细胞12 h,通过相差显微镜观察细胞形态,Western blot检测铁死亡相关蛋白表达水平。结果显示,CdCl_(2)处理后细胞活力下降,LDH、MDA和Fe^(2+)水平极显著升高(P<0.01),Nrf2、HO-1和ALOX5蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),FTH1蛋白表达水平极显著下降(P<0.01)。与CdCl_(2)处理组相比,ZnPP可以显著改善CdCl_(2)处理诱导的猪肾PK-15细胞铁死亡。ZnPP预处理组细胞形态明显好转,Nrf2、HO-1和ALOX5蛋白表达水平极显著下降(P<0.01),FTH1蛋白表达水平极显著升高(P<0.01)。结果表明,镉通过Nrf2/HO-1通路引发细胞铁过载和脂质过氧化,诱导猪肾PK-15细胞铁死亡。; 宋圣哲罗通旺沈灵俊吴亚王书杰郁孝强宋厚辉邵春艳; 关键词：镉 PK-15 HO-1

传染性胃肠炎病毒感染PK-15细胞环状RNA表达谱分析: 2024年; 【目的】分析传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染对猪肾上皮细胞(PK-15)中环状RNA(circRNA)表达的影响以及差异表达circRNA的潜在调控功能。【方法】利用Illumina HiSeq 4000测序平台对PK-15细胞(对照)和TGEV感染的PK-15细胞进行circRNA转录组测序,筛选差异表达circRNA。对差异表达circRNA来源基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,预测TGEV感染相关circRNA-miRNA-mRNA调控网络。随机挑选12种差异表达circRNAs通过实时荧光定量PCR验证其表达水平。【结果】转录组测序中共发现1029种circRNAs。相较于对照PK-15细胞,TGEV感染的PK-15细胞中共发现128种显著差异表达circRNAs,其中70种上调,58种下调。GO功能分析显示,TGEV感染的PK-15细胞中差异表达circRNAs来源基因主要富集在细胞大分子代谢过程和细胞代谢等生物过程;细胞内部分和胞内膜结合细胞器等细胞成分;有机环化合物结合和核酸结合等分子功能中。KEGG通路富集结果显示,TGEV感染的PK-15细胞中差异表达circRNAs来源基因主要富集在肌动蛋白细胞骨架调控、甲型流感、丙型肝炎、cAMP信号通路和mTOR信号通路等方面。circRNA-miRNA-mRNA调控网络显示,TGEV感染的PK-15细胞中存在庞大复杂的circRNA调控网络,多种circRNAs可通过miRNA靶向基因IFNAR1、IFNAR2和NHE3来调节先天免疫和跨膜离子转运,从而影响TGEV感染和症状。实时荧光定量PCR鉴定结果显示,12种差异表达circRNAs表达水平与测序结果基本趋势一致。【结论】TGEV改变了PK-15细胞中circRNA的表达。差异表达circRNA来源基因广泛参与细胞大分子代谢、病毒感染及cAMP信号通路等过程,与先天性免疫和TGEV发病机制相关的多个靶基因IFNAR1、IFNAR2和NHE3可能被circRNA调控。本研究结果揭示了circRNA在TGEV与宿主相互作用中的潜在功能。; 杨玺望杜芸莎刘瑞梅彩秋李文庭刘骁; 关键词：PK-15细胞

PRV感染PK-15细胞后相关炎性通路及炎症因子表达变化: 2024年; 试验旨在了解猪伪狂犬病毒(PRV)感染宿主后炎症动态变化,以猪肾细胞为宿主,选用炎性通路中Toll样受体4(TLR4)、骨髓分化一级反应蛋白88(MyD88)、核因子kB(NF-kB)和炎症因子干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)为研究指标。通过PRV感染PK-15细胞和BHK-21细胞,对比分析两者细胞感染量(TCID_(50))、细胞病变(CPE)和病毒载量;选取PRV较敏感细胞,设计炎性通路因子特异性引物,用实时荧光定量PCR检测不同时间点TLR4、MyD88和NF-kB表达量,ELISA测定IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子含量。结果显示,PK-15细胞、BHK-21细胞的TCID_(50)分别为10^(-8.98)/0.1 mL和10^(-8.58)/0.1 mL;在感染PRV第18 h均见典型CPE。PK-15细胞病毒载量较高,且18 h内PK-15的CPE程度与病毒载量呈正相关。与未感染的PK-15细胞相比,PRV感染PK-15细胞后TLR4、MyD88和NF-kB表达量均在感染后0~6 h时升高,感染后第12 h时极显著降低(P<0.01);除IFN-β外的炎症因子含量总体呈先下降后上升趋势。研究表明,PRV感染宿主过程中可引起TLR4-MyD88-NF-kB通路表达量升高,促进炎症因子变化抵抗病毒感染,TLR4-MyD88-NF-kB炎症通路在抗PRV感染过程中发挥重要作用。; 张王芝舒相华张莹杨广佳全伟储宗秀宋春莲; 关键词：PRV PK-15细胞炎症通路炎症因子 RT-QPCR

敲除LTA4H基因的PK-15细胞系构建及其对口蹄疫病毒复制的影响: 2024年; 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney-15,PK-15),探究LTA4H对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)复制的影响,为开展LTA4H功能研究及调控病毒复制机制研究提供理论依据。【方法】设计2条针对猪LTA4H基因的引导RNA(small guide RNA,sgRNA),分别构建至载体pX459-puro-MCS中;将CRISPR重组质粒转染PK-15细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选,并通过有限稀释法筛选单克隆细胞,之后通过Western blotting和测序检测LTA4H基因的敲除,获得LTA4H基因功能缺失细胞系。使用Western blotting、RT-qPCR及病毒滴度测定等方法检测敲除LTA4H基因后对FMDV复制及相关蛋白的表达情况。【结果】获得的单克隆敲除细胞系与野生型细胞相比,能够显著抑制FMDV复制。【结论】本研究成功构建了LTA4H基因敲除的PK-15细胞系,证明LTA4H对FMDV的复制具有促进作用,研究结果为后续LTA4H功能研究提供理论依据。; 王家丽蒲秀瑛杨帆邵文华黄梦瑶曹伟军曹伟军张伟; 关键词：细胞系口蹄疫病毒

羊栖菜多糖抗A型塞内卡病毒感染PK-15细胞活性和机制探究被引量：1: 2024年; 研究羊栖菜多糖抗A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染PK-15细胞的活性及机制。首先采用水提法提取羊栖菜粗多糖,然后用不同孔径超滤膜将粗多糖分为不同分子量段;通过荧光定量PCR测定不同分子量粗多糖抗SVA活性,采用水提醇沉法将抗SVA活性最高分子量段的粗多糖进行纯化并测定其细胞毒性及抗SVA活性;通过在SVA感染周期不同阶段给药研究纯化多糖的抗SVA机制。结果表明,分子量越大的粗多糖抗SVA活性越强;多糖浓度和SVA浓度均与抗SVA活性呈现量效关系,纯化后的多糖对SVA(MOI=0.1)感染PK-15细胞的治疗指数为412,1 mg/mL的多糖对SVA(MOI=10-1~104)感染PK-15细胞病毒载量的抑制率在90%~99.999%之间;不同给药时间试验结果表明,多糖能在SVA吸附或穿入细胞以及病毒复制过程发挥抗病毒作用,其中抑制SVA吸附或穿入的活性最强。本研究分离纯化得到的羊栖菜多糖有很强的抗SVA活性,可为后续抗SVA药物的研发提供参考。; 张诗悦张亮张伟张伟杨少华高星熠杨少华李宝国杨宏军; 关键词：羊栖菜多糖纯化抗病毒

猪圆环病毒2型ORF9基因对PK-15细胞的影响: 2024年; 为探究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF9基因对猪肾细胞(PK-15)的影响,通过构建ORF9基因真核表达质粒,并转染至PK-15细胞中,采用流式细胞术及qRT-PCR方法检测过表达ORF9基因对PK-15增殖、凋亡、免疫的影响。结果显示,PCV2ORF9基因过表达可显著增加内质网应激标志基因GRP78的表达水平;增加PK-15细胞S期细胞数,使细胞增殖速率增快;增加PK-15细胞凋亡率,上调凋亡相关基因caspase-3、caspase-8、caspase-9、p53和Bax的表达水平(P<0.01),下调凋亡相关基因Bcl-2的表达水平;上调免疫相关基因IL-8、IL-10、NF-κB、TNF-α的表达水平(P<0.01),下调免疫相关基因IL-2、IFN-β、IL-12的表达水平(P<0.01)。结果表明,PCV2ORF9基因可能促进PK-15细胞增殖与凋亡,并在PK-15细胞逃逸过程中发挥一定作用。; 边孟婷梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥柳佳佳黄书潘向英田红利; 关键词：猪圆环病毒2型增殖凋亡免疫

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