教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-07-0031)
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 相关作者：赵威张志谦韩海勃更多>>
- 相关机构：北京大学肿瘤医院北京大学临床肿瘤学院更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 小鼠抗人Myosin Va多克隆抗体的制备和鉴定被引量：3
- 2009年
- 目的:制备Myosin Va多克隆抗体,为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供工具。方法:PCR扩增编码人Myosin Va C末端(MyoVaCT)278个氨基酸的cD-NA片段,DNA重组入原核表达质粒pET28a,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半糖苷(IPTG)诱导表达His-MyoVaCT融合蛋白。经电泳纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。通过ELISA和免疫荧光法鉴定血清特异抗体效价和特异性。结果:成功构建了pET28a/MyoVaCT原核表达载体,转化BL21后可高效表达融合蛋白His-MyoVaCT,纯化蛋白免疫小鼠后产生的Myosin Va多抗可特异检测细胞内源性Myosin Va的表达及定位情况,同时能特异识别细胞内外源表达的Myosin Va分子。结论:获得了效价和特异性都良好的Myosin Va抗体,适合应用于Myosin Va的检测。
- 韩海勃蓝林祥张志谦赵威
- 关键词：MYOSINVA融合蛋白多克隆抗体
- Myosin Va RNAi慢病毒载体的构建及对肺癌PG细胞运动和迁移能力的影响被引量：1
- 2009年
- 目的构建人非常规肌球蛋白myosinVa基因RNAi慢病毒载体,并探讨其对人肺巨细胞癌PG细胞运动和迁移能力的影响。方法针对已经筛选确定的myosinVa基因RNAi有效靶序列,合成靶序列及其阴性对照的寡聚DNA,并连接到pSuper载体获得中间实验质粒pSuper-shM5A及阴性对照pSuper-shCON;然后将H1promoter-shM5A/shCON表达框重组到慢病毒载体plenti4上,分别得到plenti4-H1-shM5A和shCON载体,并进行慢病毒包装。随后用病毒上清感染PG细胞,并筛选出zeocin抗性的稳定细胞系PG-shM5A和shCON。通过RT-PCR方法检测PG-shM5A和shCON细胞的myosinVamRNA表达水平;用创伤愈合和Boyden小室实验测定PG-shM5A和shCON细胞的运动和迁移能力。结果限制性内切酶酶切和测序证实,成功构建myosinVaRNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A。慢病毒包装成功后,感染PG细胞并获得zeocin抗性的细胞;用RT-PCR方法证明,myosinVamRNA被抑制70%以上。创伤愈合和Boyden小室实验表明,感染携带myosinVaRNAi慢病毒的PG细胞运动和迁移能力显著下调。结论成功构建myosinVaRNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A,它能有效抑制人肺巨细胞癌PG细胞的myosinVa表达并降低其运动和迁移能力,初步揭示了myosinVa与肿瘤细胞恶性行为的相关性。
- 蓝林祥杜艳涛赵威张志谦
- 关键词：MYOSINVA慢病毒迁移肺巨细胞癌
- Twist促进人肝癌细胞的迁移被引量：1
- 2010年
- 目的:研究Twist对肝癌细胞迁移能力的影响。方法:RT-PCR方法检测Hep-11和Hep-12中Twist的表达情况。将Twist-cDNA转染Hep-11筛选得到稳定高表达Twist的细胞克隆Twist-Hep-11。构建pSuper-Twist-shRNA干扰载体,瞬时转染Hep-12细胞。用Boyden小室检测过表达和抑制Twist基因后对细胞迁移和侵袭能力的影响。RT-PCR和Western blot检测Hep-11上调Twist后的EMT标志分子的表达。结果:与Hep-11相比,Hep-12的Twist基因表达显著上调,Hep-12的迁移能力也强于Hep-11。Hep-11细胞过表达Twist后,其迁移能力明显增强;而干扰Hep-12细胞Twist表达后,其迁移能力亦明显下降。Hep-11过表达Twist后,N-cad、Vimentin表达明显上调,E-cad变化不明显。结论:Twist可以促进肝癌细胞的迁移,其机制可能与N-cad、Vimentin表达上调有关。
- 杜艳涛韩海勃赵威张志谦
- 关键词：TWISTRNA干扰基因转染迁移
