北京市自然科学基金(7053066)
- 作品数：4 被引量：9H指数：2
- 相关作者：尤红丛敏徐雍唐淑珍刘晓明更多>>
- 相关机构：首都医科大学附属北京友谊医院更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金北京市科技新星计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生化学工程更多>>
- 以腺相关病毒为载体的小干扰RNA对肝星状细胞中金属蛋白酶组织抑制因子的抑制作用被引量：1
- 2006年
- 目的观察以腺相关病毒(AAV)为载体含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1的表达抑制作用。方法针对大鼠TIMP-1 mRNA基因序列挑选一段22bp片段,在体外构建为短发夹siRNA (shon hairpin siRNA,shRNA)表达载体后,将其包装为重组AAV并感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后,于感染后30d及90d应用荧光定量PCR方法及Western blot方法分别检测TIMP-1 mRNA及蛋白质表达情况,同时通过PCR技术以感染后细胞的基因组DNA为模板扩增外源基因验证其长效表达。结果经PCR、酶切及序列测定证实含有siRNA-TIMP-1基因的重组AAV载体质粒已成功克隆。将重组质粒包装成病毒后感染HSC-T6细胞,与对照组细胞相比,感染后30d及90d细胞TIMP-1 mRNA水平明显降低(P＜0．01),感染后30d TIMP-1蛋白表达水平较对照组细胞相比下降约60％,而感染后90d,TIMP-1蛋白表达几乎下降90％。PCR结果显示在重组病毒感染后90d细胞基因组DNA中仍可扩增出外源基因,证实外源基因可长期表达。结论重组病毒rAAV/siPtNA-TIMP-1/neo可长期有效地抑制TIMP-1基因的表达。
- 丛敏王萍刘天会徐雍卢炎唐淑珍刘晓明王宝恩贾继东尤红
- 关键词：金属蛋白酶组织抑制因子小干扰RNA腺相关病毒肝星状细胞
- 腺相关病毒介导的小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1及基质金属蛋白酶13表达的影响被引量：4
- 2007年
- 目的观察以腺相关病毒(AAV)为载体含有针对金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1及基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达情况。方法将对大鼠TIMP-1基因具有最强抑制作用的一对siRNA,在体外构建为短发夹siRNA表达载体后,将其包装为重组AAV-rAAV/siRNA-TIMP-1/neo并感染HSC-T6,于感染后4周及12周应用荧光定量PCR方法及Western blot方法分别检测TIMP-1及MMP13mRNA及蛋白质表达情况。结果经PCR、酶切及序列测定证实抑制作用最强的1对siRNA在体外构建的shRNA表达载体成功克隆。将重组质粒包装成病毒后感染HSC-T6细胞,与对照组细胞相比,rAAV/siRNA-TIMP-1/neo感染组在感染后4周及12周细胞TIMP-1mRNA及蛋白质表达水平明显降低(P<0.01),而MMP13mRNA及蛋白质表达水平明显增高(P<0.01)。结论化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可长期有效地抑制TIMP-1基因表达。
- 丛敏刘天会徐雍卢炎唐淑珍刘晓明王宝恩贾继东尤红
- 关键词：金属蛋白酶组织抑制因子小干扰RNA腺相关病毒肝星状细胞
- 小干扰RNA对肝星状细胞基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用被引量：4
- 2006年
- 目的观察化学合成的小干扰RNA（siRNA）转染大鼠肝星状细胞（HSC）-T6后不同时间点，对基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的抑制作用，同时筛选高效的siRNA片断。方法对大鼠TIMP-1 mRNA nt161～181、nt190～208、nt208—226、nt226～244及nt445～463化学合成的5对siRNA和1对荧光标记的非特异siRNA（与TIMP-1 mRNA无同源性的FITC标记的21nt siRNA），在阳离子脂质体的介导下将不同浓度的非特异siRNA转染至大鼠HSC-T6后，用流式细胞仪确定最佳转染浓度。提取转染50nmol／L siRNAs后24h，48h和72h细胞蛋白，用Western blot检测TIMP-1蛋白质表达，筛选出抑制效率最高的siRNA，同时确定siRNA转染细胞后的最佳作用时间。结果50nmoL／L siRNAs对HSC-T6有较高的转染效率；5对siRNA中的3对在转染后48h有较强的抑制HSC-T6细胞TIMP-1基因表达的作用，其中抑制作用最强的1对siRNA对TIMP-1表达的抑制作用与对照组相比可增强80％以上，而在转染后72h，其抑制作用基本消失。结论化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达，筛选到的高效阻抑TIMP-1表达的siRNA可构建于病毒载体，以实现长期抑制TIMP-1表达的功效。
- 丛敏王萍刘天会徐雍卢炎唐淑珍刘晓明王宝恩贾继东尤红
- 关键词：金属蛋白酶组织抑制因子-1小干扰RNA肝星状细胞
- 反义及小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用被引量：2
- 2006年
- 目的观察以腺相关病毒(AAV)为载体,含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1的反义RNA及小干扰RNA(siRNA)的重组AAV(rAAV/ANTI-TIMP-1/neo及rAAV/siRNA-TIMP-1/neo)感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后,TIMP-1表达的受抑制情况。方法经聚合酶链反应(PCR)扩增及酶切后连接,将针对TIMP-1的反义RNA片段及siRNA片段分别构建于AAV载体中并测序鉴定,将其包装成重组病毒后感染大鼠肝星状细胞系HSC- T6,同时设空白对照组。经G418以400μg/ml的浓度筛选30d后,分别应用荧光定量PCR技术及Western blot检测重组病毒感染组及空白对照组HSC-T6 TIMP-1的基因转录及蛋白质表达水平。结果经PCR、酶切及序列测定证实,两种重组AAV载体质粒(pd16-95/ANTI-TIMP-1/neo和pd16-95/siRNA-TIMP—1/neo)克隆成功。将重组质粒包装成病毒感染HSC-T6细胞30 d后,通过荧光定量PCR技术及Western blot分析显示,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP- 1/neo组与对照组细胞相比,HSC-T6中的TIMP-1基因的转录被抑制(P＜0．01),且表达水平与对照组相比约下降60%；而rAAV/ANTI-TIMP-1/neo组及空载体组与对照组相比TIMP-1基因的转录及表达水平差异无统计学意义(P＞0．05)。结论通过AAV载体技术重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可有效地抑制TIMP-1基因的表达,而针对TIMP-1基因全长的重组病毒rAAV/ANTI-TIMP-1/neo对体外培养的HSC-T6细胞TIMP-1基因的转录与表达无明显抑制作用。
- 丛敏王萍刘天会徐雍卢炎唐淑珍刘晓明王宝恩贾继东尤红
- 关键词：金属蛋白酶组织抑制因子-1小干扰RNA腺相关病毒肝星状细胞
