国家自然科学基金(31000368)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
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- 人GALNT3-sol蛋白的原核表达和抗体制备被引量：3
- 2011年
- 目的:构建人乙酰半乳糖胺转移酶3可溶性区域(GALNT3-sol)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化GALNT3-sol蛋白,制备小鼠抗人GALNT3-sol多克隆抗体,并对抗体的基本特性进行了检测。方法:RT-PCR扩增编码人GALNT3-sol的cDNA片段(1755bp),将其克隆至原核表达载体pET15b中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,诱导表达人GALNT3-sol重组蛋白。将变性、复性和电泳纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗血清。分别采用ELISA和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果:成功构建了pET15b/GALNT3-sol原核表达载体,转化BL21(DE3)后可高效表达重组蛋白GALNT3-sol,获得的小鼠抗人GALNT3-sol多克隆抗血清效价达1∶25600,并有良好的特异性。结论:成功获得人GALNT3-sol蛋白,得到了效价和特异性良好的小鼠抗人GALNT3-sol抗体,为进一步研究人GALNT3在肿瘤组织中的表达提供了可靠的材料。
- 孔蕴郜海涛李树芳王鹏顾黎
- 关键词：大肠杆菌多克隆抗体
- 新骨架小分子南强菌素对紫杉醇耐药性的逆转作用及其机制
- 2013年
- 目的研究南强菌素(DM)对肿瘤细胞紫杉醇耐药性的逆转作用并探讨其逆转机制。方法 MTT法检测南强菌素对A549/T耐药细胞与A549敏感细胞的毒性及其对紫杉醇敏感性的影响,以Annexin V法检测细胞凋亡率和Rh123在耐药细胞中的积累,HPLC测定细胞内紫杉醇的蓄积量,Western blotting检测Ⅲ型β微管蛋白的表达水平。结果南强菌素可显著提高A549/T细胞对紫杉醇的敏感性,增加紫杉醇诱导耐药细胞凋亡率,增强A549/T细胞中紫杉醇和Rh123的蓄积能力,同时,亦可明显抑制A549/T细胞中Ⅲ型β微管蛋白的表达水平。结论南强菌素可有效提高耐药细胞对紫杉醇的敏感性,逆转A549/T细胞对紫杉醇的耐药作用,其逆转机制可能与南强菌素抑制耐药肿瘤细胞膜上耐药蛋白P-糖蛋白的外泵转运功能和干扰Ⅲ型β微管蛋白的表达水平有关。
- 张成梅武传涛朱珊珊贾舒王一史艳秋
- 关键词：紫杉醇肿瘤细胞多药耐药性A549
- 重组人GALNT3-sol蛋白在毕赤酵母中的高效表达和活性鉴定
- 2012年
- 目的:为了获得有催化活性的人乙酰半乳糖胺转移酶3(GALNT3),构建了GALNT3可溶性区域(GALNT3-sol)的真核分泌表达载体,在巴斯德毕赤酵母中表达并纯化GALNT3-sol蛋白,体外检测其转糖基活性。方法:以构建好的pET15b/GALNT3-sol为模板进行PCR,扩增编码人GALNT3-sol的cDNA片段(1 755 bp),将其克隆至真核表达载体pPIC9K,载体线性化后采用电击法转化毕赤酵母GS115。通过MD平板和G418平板筛选出阳性高拷贝重组菌株。阳性菌株经过甲醇诱导表达人GALNT3-sol重组蛋白,表达上清进行Ni-NAT分离纯化。分别采用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的重组蛋白,并使用HPLC和MALDI-TOF/MS分析其转糖基化反应的活性。结果:成功构建了能够分泌表达GALNT3-sol的毕赤酵母菌株。阳性表达菌株在BMMY培养基(pH 6.0)中20℃培养,经0.5%甲醇诱导表达96 h,摇瓶表达量可达5mg/L。SDS-PAGE和Western blot结果显示表达重组蛋白为糖基化形式。活性检测显示表达的重组蛋白具有转糖基活性。结论:成功获得可以高效分泌表达具有活性的人GALNT3-sol蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究人GALNT3的性质及其应用提供了基础。
- 孔蕴郜海涛李树芳王鹏顾国锋顾黎
- 关键词：毕赤酵母分泌表达活性
- 南强菌素在大鼠体内的药动学、组织分布及排泄研究
- 2014年
- 目的研究海洋新骨架小分子南强菌素经单次静脉注射后在Wistar大鼠体内的药动学、组织分布及排泄特征。方法48只Wistar大鼠（雌雄各半）分为8组（每组雌雄各三只），3组分别尾静脉注射南强菌素10、20、30mg·kg^-1，液相色谱-串联质谱法（LC—MS／MS）测定其血药浓度，DAS2．0计算药动学参数；其余5组单次尾静脉给予南强菌素20mg·kg^-1，其中3组大鼠给药后0．5、2、3h麻醉处死、解剖测定南强菌素组织分布，1组给药后收集0—2h、〉2—4h、〉4～8h、〉8～24h的尿液粪便评价南强菌素的排泄过程，1组麻醉后插管收取0～2h、〉2～16h、〉16～24h胆汁评价胆汁排泄。结果大鼠分别静脉单次注射10、20、30mg·kg。南强菌素后，t1/2 2分别为（2．09±0．68）、（2．44±0．35）、（2．57±1．33）h，AUCo-8h分别为（3378±544）、（3492±460）、（4451±573）μg·h·L^-1；单次静脉给药20mg·kg^-1，0．5h后肾脏组织中的南强菌素含量最高（1736．8ng·^g-1），肺脏及脾脏次之；给药2h后，多数组织中已经检测不到或仅能检测到极少量南强菌素；原型药物经尿样和胆汁的排泄率分别为1．87％和0．91％，粪便的排泄率极低，低于总给药量的0．01％。结论单次给予南强菌素，各剂量组的AUC0-8h、ρmax和t1/2 2.用SPSS进行相关检验，无显著差异（P〉0．05），表明在置信度（单双侧）0．05水平上剂量与AUC0-8h、和t1/22均不相关；原型药物经粪便和尿样排泄率较低，1～24h内仅有1．87％从尿液中排出。
- 朱珊珊张成梅武传涛贾舒王一史艳秋
- 关键词：药动学排泄色谱法高压液相串联质谱法
