国家自然科学基金(31000346)
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
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- E.coliRecQ解旋酶克隆表达纯化及生物学活性检测被引量：4
- 2013年
- RecQ解旋酶是生物分子代谢过程中重要的大分子物质,对保持遗传物质的稳定性具有重要作用。通过PCR从E.coli DH5α菌株的基因组中扩增出E.coli RecQ基因并克隆入原核表达载体pET24a(+)中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中。优化表达条件后,经镍柱螯合亲和层析纯化获得纯度大于90%的目标蛋白质,应用生物化学和生物物理学技术研究E.coli RecQ解旋酶的生物学活性。结果表明,E.coli RecQ解旋酶具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性的ATP水解活性。在等蛋白质浓度下,E.coli RecQ酶结合DNA活性强弱依次为开叉dsDNA,ssDNA,平末端dsDNA。其还具有ATP依赖的dsDNA解链活性和时间依赖的DNA退火活性。实验为RecQ解旋酶家族其他重要成员的活性功能研究提供了理论依据和重要参考。
- 黄振蓉吴海丽张三军杜冰钱旻任华
- 关键词：蛋白表达蛋白纯化生物学活性
- Bacillus subtilis RecQ酶精氨酸突变体表达纯化及活性检测
- 2013年
- RecQ解旋酶是生物分子代谢过程中重要的大分子物质,对保持遗传物质的稳定性具有重要作用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RecQ解旋酶中精氨酸可能在其对ATP水解和结合中起到重要的作用。通过PCR以Bacillus subtilis 168中抽提的基因组DNA为模板扩增得到大小为1.5kb的RecQ基因片段,并用重叠PCR定点突变法将该RecQ基因中的精氨酸残基(arg319和arg322)分别进行单突变和双突变,并将野生型和突变型基因克隆入原核表达载体pET24a(+)中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,所有目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中。优化表达条件后,经镍柱螯合亲和层析纯化获得纯度大于90%的目标蛋白质,检测野生型和突变型蛋白的ATP水解活性。结果表明,Bacillus subtilis RecQ解旋酶具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性的ATP水解活性。其arg319和arg322突变后,RecQ酶的ATP水解活性明显减弱,表明这两个精氨酸残基参与RecQ酶与ATP的相互作用。实验为RecQ解旋酶家族其他重要成员的活性功能研究提供了理论依据和重要参考。
- 吴海丽张三军杜冰钱旻任华
- 关键词：枯草芽孢杆菌蛋白表达蛋白纯化
- 一种新型免疫毒素IAB-TAT-BH3的表达、纯化及初步鉴定
- 2013年
- 利用能与CA125结合的间皮素最小活性片段IAB与跨膜肽TAT和凋亡肽BH3连接后,插入至质粒pET32a(+)中,构建成免疫毒素IAB-TAT-BH3融合表达载体pET32a(+)-IAB-TAT-BH3。将此重组质粒及对照组质粒pET32a(+)-IAB-BH3分别转化E.coli BL21(DE3),表达后经western blot验证,获得了相应的可溶性蛋白表达产物。表达菌的裂解上清经镍柱亲和层析、超滤脱盐后,分别收集到高纯度且浓度均大于250μg/ml的融合蛋白。经MTT检测,这两种融合蛋白针对细胞表面表达有受体蛋白CA125的癌细胞并具有抑制其增殖的作用。其中IAB-TAT-BH3与对照IAB-BH3相比,具有更强抑制细胞增殖的作用。IAB-TAT-BH3这一新型免疫毒素的表达、纯化及初步鉴定,为CA125阳性癌细胞的靶向治疗研究奠定了基础。
- 范鸣滕云飞虞丽平杜冰何苗壮钱旻任华
- 关键词：CA125免疫毒素纯化
