国家自然科学基金(30370606)
- 作品数：10 被引量：35H指数：3
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- 慢病毒介导的人凝血因子Ⅷ高效真核表达系统的建立
- 2013年
- 目的应用慢病毒载体系统建立高效稳定表达人凝血因子Ⅷ（FⅧ）的细胞株并评估该表达系统的生物安全性。方法构建携带人B区缺失FⅧ（BDDhFⅧ）和绿色荧光蛋白基因的慢病毒转移质粒BDDhFⅧ／pXZ9及对照pXZ9，包装并浓缩慢病毒颗粒。体外感染中国地鼠卵巢（CHO）细胞后72h取培养上清，ELISA法测定FⅧ抗原表达水平，一期促凝法测定FⅧ活性，RT-PCR检测感染后CHO细胞中FN的转录。检测载体复制能力以评估安全性。结果成功构建携带BDDhFⅧ和绿色荧光蛋白基因的慢病毒转移质粒BDDhFⅧ／pXZ9及对照质粒pXZ9，并制备出高滴度的慢病毒。该慢病毒载体可高效感染CHO细胞，感染后72h培养上清中FⅧ抗原浓度为（1724．9±283．7）mU／ml，FⅧ活性为（10．58±1．55）％，RT-PCR检测到BDDhFⅧ基因的转录。感染后的CHO细胞未检测到gag基因的表达，培养上清中也未检测到病毒。结论慢病毒可以介导人FⅧ在CHO细胞内高效表达；该表达系统不产生子代病毒，具有良好的生物安全性。
- 宋旭光曹江曾令宇张焕新程海王缦王力陈翀徐开林
- 关键词：慢病毒属真核表达中国地鼠卵巢细胞
- 慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达被引量：15
- 2007年
- 本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。
- 李振宇徐开林潘秀英孙海英高飞鹿群先李德鹏何徐彭
- 关键词：慢病毒载体T淋巴细胞绿色荧光蛋白基因
- 慢病毒介导的血友病B基因在离体细胞中的表达被引量：3
- 2008年
- 目的构建泛醌肩动子（PUB）驱动的携带犬凝血因子Ⅸ（cFⅨ）基因的慢病毒三质粒表达载体，将其包装成病毒后，观察是否能在体外获得有效的cFⅨ表达。方法采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒ANRF、包膜蛋白质粒VSV—G和构建的重组转移质粒PTK164共转染293T包装细胞产生慢病毒颗粒，病毒以MOI3：1比例感染培养的第三代骨髓基质细胞和293T细胞，用一期法测定细胞培养上清中cFⅨ活性。结果体外成功培养出骨髓基质细胞，经病毒感染后的骨髓基质细胞和293T细胞均能表达FIX因子，活性分别为（26．30±2．10）％和（19．70±1．53）％，与对照组[（1．00±0．05）％]比较，差异有统计学意义。结论成功构建PUB启动子驱动的cFⅨ基因的三质粒慢病毒表达载体，包装成病毒颗粒后成功转染至培养的骨髓基质细胞和293T细胞。
- 闫冬梅徐开林杜冰曾令宇鹿群先潘秀英
- 关键词：慢病毒血友病B骨髓基质细胞
- 人骨髓基质细胞的培养及鉴定被引量：6
- 2009年
- 目的:探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法,为基因治疗提供载体细胞。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离人骨髓进行体外培养扩增,用倒置显微镜观察细胞形态学特征并用流式细胞仪鉴定其CD90表达。结果:分离培养的骨髓基质细胞似成纤维状,原代细胞呈集落生长,并可表达CD90,传代后细胞形态较一致,且随着传代次数的增加CD90表达越高,第3代可达94.31%。结论:骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得,随着传代次数增加,纯度越高,该方法是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法。
- 闫冬梅徐开林杜冰鹿群先曾令宇
- 关键词：骨髓基质细胞骨髓细胞培养流式细胞仪
- B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达被引量：5
- 2007年
- 本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体,观察其在293T细胞中的表达情况。用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208,构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ;用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,包装后感染293T细胞,并以pXZ171作为对照。在感染后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFⅧ基因的转录,一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性,流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果表明:成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,其基因转导染效率达到了59.57%。RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA。感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ∶C)分别为12%、43%、87%。PCR法扩增出了534bp的特异性片段。结论:成功构建的慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FⅧ,提示基因治疗可应用于血友病A。
- 程海徐开林孙海英杜冰曾令宇鹿群先何徐彭潘秀英
- 关键词：慢病毒体外表达
- siRNA特异性抑制HEL细胞evi1基因的实验研究被引量：1
- 2010年
- 本研究探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默人红白细胞白血病细胞(HEL)的evi1基因后对细胞evi1基因表达的抑制作用及细胞生物学特征变化及其作用机制。体外合成3条evi1基因特异性的siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)并转染HEL细胞,并设对照。用四甲基偶氮唑蓝法评价细胞增殖抑制情况,半定量逆转录聚合酶链反应(semiquantitative RT-PCR)检测evi1基因mRNA的表达,台盼蓝染色试验测定细胞活性的变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。结果显示,细胞转染24、48、72小时后,以siRNA-1作用最强,转染后48小时抑制作用最明显。siRNA浓度为120nmol/L时,抑制率达到最大。转染48小时后siRNA-1对HEL细胞的增殖抑制率为(72.22±2.80)%,evi1-mRNA相对表达率为(27.31±1.11)%,HEL细胞活率为(26.05±2.49)%,与其他各组相比有显著性差异(p<0.001)。siRNA可使细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,凋亡率明显增高(p<0.01)。结论:evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,使evi1-mRNA表达水平降低,细胞活性下降,HEL细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂,促进细胞凋亡。
- 张璞徐开林杜冰闫冬梅潘秀英
- 关键词：SIRNAHEL细胞
- 人凝血因子Ⅷ体外高效表达体系的建立被引量：1
- 2009年
- 目的构建含有人凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因的慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ，观察其在体外培养细胞中的表达情况。方法用限制性内切酶酶切法获得B区缺失的人FⅧ基因（BDDhFⅧcDNA）片段，将其克隆至慢病毒载体pXZ208的多克隆位点，构建慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ，限制性内切酶酶切法鉴定载体的连接方向。采用三质粒共转染293T细胞制备病毒颗粒，包装后感染人肺、肾HLF细胞、张氏肝（Chang—Liver）细胞和成人骨髓基质细胞（MSC），并以pXZ171作为对照。流式细胞术（FCM）检测载体的感染效率，一期法检测细胞培养上清中FⅧ的活性，PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果成功构建了慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ，包装后能有效感染多种靶细胞，感染效率分别为：HLF细胞（74．52±7．57）％、MSC（42．34±5．84）％和Chang-Live细胞（27．24±6．53）％。感染后48h检测到HLF细胞、Chang—Liver细胞和MSC培养上清中有FⅧ的表达，FⅧ活性分别为（54．1±5．6）％、（22．5±2．9）％和（12．5±2．7）％。PCR检测到目的基因的整合。结论成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ，在体外可以有效感染多种靶细胞并表达有活性的FⅧ。
- 程海徐开林孙海英鹿群先何徐彭潘秀英
- 关键词：慢病毒属血友病A体外表达基因治疗
- 体外阻断CD137-CD137L途径控制小鼠移植物抗宿主病的研究被引量：3
- 2007年
- 目的探讨体外阻断活化的供鼠T淋巴细胞CD137-CD137L共刺激途径控制小鼠异基因骨髓移植（allo-BMT）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）及其机制。方法供、受鼠的淋巴细胞体外混合培养，分别加入抗CD137L单抗或不加抗CD137L单抗培养后与供鼠骨髓细胞混合移植给受鼠。采用流式细胞术检测移植后受鼠T细胞亚群的变化，RT-PCR法检测细胞因子mRNA表达水平的变化，观察移植后受鼠GVHD的临床及病理改变。结果与未用抗CD137L单抗组相比，应用抗CD137L单抗组CD3^＋CD8^＋T细胞明显降低（P＜0．01）；IFN-γ表达水平明显减低（P＜0．01），IL-10的表达水平明显升高（P＜0．01）。移植后未预防GVHD组（A组）小鼠移植后15d内均死于aGVHD。采用甲氨蝶呤＋环孢素预防GVHD组（B组）小鼠100％发生aGVHD，但临床及病理改变程度较A组轻，平均存活时间[（9．5±2．5）d]较A组[（7．5±1．5）d]略有延长。采用抗CD137L单抗预防GVHD组（C组）受鼠aGVHD的发生率为70％，程度比A、B两组轻，与A、B两组相比生存率明显提高（P＜0．01），平均存活时间[（16．0±2．5）d]明显延长（P＜0．01），30％的小鼠生存时间大于30d。结论抗CD137L单抗体外阻断CD137-CD137L共刺激途径能有效控制小鼠GVHD，可能与影响Ⅰ类和Ⅱ类T细胞因子平衡有关。
- 李朝虹徐开林潘秀英杜冰
- 关键词：骨髓移植移植物抗宿主病CD137L免疫耐受
- 恶性淋巴瘤患者采用MAG方案进行干细胞动员的疗效观察被引量：2
- 2011年
- 目的观察恶性淋巴瘤患者进行自体外周血造血干细胞移植（APBSCT）前采用MAG方案动员干细胞的疗效。方法对进行APBSCT的12例恶性淋巴瘤患者，移植前动员均采用MAG方案，具体为阿糖胞苷（Ara-C）2g/m^2。每12h1次，第1-2天；米托蒽醌（MTZ）10mg/m^2，第2、3天。白细胞（WBC）计数〈1．0×109／L时开始使用重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）150μg/d，WBC计数〈0．5×10^9／L时采用rhG-CSF300μg/d，WBC计数开始回升时，每日检测血常规和观察外周血涂片，当外周血涂片中出现原始或幼稚细胞时给予rhG-CSF300μg，每12h1次，使用CS．3000血细胞分离机连续2d采集外周血干细胞并冻存备用。结果12例患者经MAG方案动员后，并发症主要为轻度感染。经两次采集，共采集到单个核细胞（MNC）（5．24±0．81）×10^8/kg，CD34^＋细胞（8．16±2．25）×10^6/kg，均达到采集要求。结论恶性淋巴瘤患者采用MAG方案进行干细胞动员、采集，结果稳定可靠，安全性好。
- 张璞徐开林孙海英刘琼鹿群先潘秀英
- 关键词：淋巴瘤米托蒽醌造血干细胞
- Evi1基因特异性siRNA对HEL细胞生长周期的影响
- 2011年
- 目的研究Evi1基因特异性小干扰RNA(siRNA)对人红白细胞白血病(HEL)细胞增殖及生长周期的影响。方法将HEL细胞分为三组:Evi1基因siRNA组(A组)、siRNA-co对照组(B组)、细胞空白对照组(C组)。转染48 h后,台盼蓝染色实验检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率。结果与B、C组相比,A组HEL细胞活性下降[(97.13±1.58)%、(99.20±2.27)%vs.(26.05±2.49)%],细胞周期阻滞在G0/G1期[(39.61±1.32)%、(35.77±1.31)%vs.(79.07±1.43)%],S期细胞减少[(57.74±1.08)%(、57.36±1.38)%vs.(9.51±0.75)%],凋亡率增高[(9.78±1.14)%(、8.67±1.89)%vs.(49.94±1.75)%](P均<0.05);而B组和C组间各观察指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,促进细胞凋亡。
- 张璞徐开林潘秀英杜冰
- 关键词：小干扰RNA
