国家自然科学基金(30400418)
- 作品数：11 被引量：25H指数：3
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- 人DcR3cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达
- 2006年
- 目的克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞。方法以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定。将测序正确的DcR3cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体。采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达。结果PCR方法扩增出一1000bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA。将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达。结论成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子。
- 王槐志黎万玲董家鸿倪兵姜曼吴玉章
- 关键词：DCR3COS-7细胞基因表达
- 程序性死亡配体-1基因转染对大鼠肝移植术后细胞因子的影响被引量：2
- 2013年
- 目的 观察腺相关病毒（AAV）介导的程序性死亡配体-1（PD-L1）基因转染对大鼠肝移植术后干扰素（INF）-γ、白细胞介素（IL）-17、IL-10及转化生长因子-β1 （TGF-β1）等的影响.方法 96只近交系大鼠随机分为等基因组（G1）、同种异体组（G2）、空载体组（G3）和转染组（G4）,每组12对.通过大鼠肝移植急性排斥模型,采用夹闭法将PD-L1-AAV2-红色荧光蛋白（RFP）转染供肝,观察大鼠中位生存时间（MST）,全自动生化分析仪测定肝功能,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测受体移植肝IL-10、IL-17、INF-γ及TGF-β1的表达.结果 G1组全部存活;G2、G3组MST分别为18（17 ～20）、18（17～19） d;G4组显著延长了其存活（MST 29 d）（P＜0.05）.术后14d G4组肝功能及病理变化与7d G2、G3组相似.除G1组1NF-γ无表达外,余组移植肝INF-γ与IL-17表达类似.G1组术后7 d IL-17水平明显升高,后渐降至28.9 ng/g,仍高于3d;G2、G3组移植肝INF-γ、IL-17水平3d高表达,并渐增强,均在14d达峰值418.6、382.9 ng/g.而G4组虽高表达,但其幅度及浓度均低于G2、G3组,除G4组3d外,差异有统计学意义（Jp＜0.05）.各组移植肝TGF-β1与IL-I0表达类似,G1组术后3d升高至170.2、106.2 ng/g,后渐降,但仍高于G2、G3组;而G4组术后3d高表达,14d达峰值564.1、614.9 ng/g,除G4组3d外,各组TGF-β1、IL-10均高于G2、G3组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 AAV介导的PD-L1基因转染可延长移植肝的存活,其机制可能是基因转染增强了PD-L1/PD-1信号通路,在上调IL-10、TGF-β1表达的同时,下调INF-γ、IL-17的表达,从而发挥对移植肝的保护作用.
- 邵永王槐志董家鸿别平张玉君倪斌
- 关键词：程序性死亡配体-1腺相关病毒基因转染近交系大鼠细胞因子
- 重组腺相关病毒介导的PD-L1基因在大鼠移植肝中的表达
- 2008年
- 目的探讨供肝转染PD-L1-AAV2-RFP后基因的表达情况。方法近交系BN大鼠随机分3组:同基因肝移植组(ISO组)、腺相关病毒空载体组(AAV组)、基因转染组(PD-L1组),每组6对。ISO组供肝冷保存期经门静脉注射生理盐水2mL,保存2h后采用改良"二袖套法"行原位肝移植;AAV、PD-L1组所用灌注液分别为AAV2-RFP空病毒颗粒和PD-L1-AAV2-RFP(1×1011v.g./只)。术后7、14d各取3只大鼠采血测定肝功能,取肝组织即刻行冰冻切片在荧光显微镜下观察RFP的表达,免疫组化染色法检测PD-L1蛋白的表达。结果3组术后7d谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)均明显增高,14d后基本恢复正常,各组间相比均无显著性差异(P>0.05);术后7d在荧光显微镜下AAV、PD-L1组移植肝可见少量而微弱的红色荧光,14d可见高亮度的红色荧光,而各组肝外组织及ISO组各时段均未见红色荧光;免疫组化染色结果示未转染组PD-L1蛋白均微弱表达,而PD-L1转染7d后随时间延长靶基因表达逐渐增强(P<0.05)。结论重组腺相关病毒介导,体外冷保存期经门静脉途径供肝转染PD-L1,可以使PD-L1基因在肝内获得安全、有效的表达。
- 邵永董家鸿王槐志王曙光别平李晓武张玉君陈永文倪兵
- 关键词：程序性死亡配体-1肝移植基因转染
- 近交系大鼠肝移植急性排斥模型的建立及排斥反应观察被引量：2
- 2008年
- 目的建立近交系大鼠肝移植急性排斥模型并观察其排斥反应的规律。方法近交系大鼠随机分为G1(BN-BN)、G2(SD-Wistar)和G3(LEW-BN)3组,每组18对。采用改良"二袖套法"大鼠原位肝移植模型,观察一般情况,生存期,术后第3、7、14、21天血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBIL)及移植肝病理学变化,根据Banff标准判断排斥反应强度。结果G1、G2大鼠1月存活率为100%;G3大鼠急性排斥反应于术后第3天始发生,第7天后逐渐加重,第14天达到高峰,除并发症致死外,余大鼠均在20天内死于Ⅲ级排斥反应。G3术后各时相点ALT、TBIL均明显高于G1、G2(P<0.05)。G3移植肝病理检查呈典型的排斥反应,而G1、G2没有。结论LEW-BN大鼠组合为稳定的大鼠肝移植急性排斥模型;但近交系大鼠手术耐受性差,建模难度大,熟练的显微外科技术是模型成功的关键。
- 邵永董家鸿王曙光别平李晓武王槐志张玉君李昆
- 关键词：肝移植近交系大鼠
- 腺相关病毒介导的PD-L1基因转染对大鼠肝移植术后肝脏的保护作用
- 2013年
- 目的：探讨腺相关病毒（AAV）介导的PD—L1基因转染对大鼠移植肝的保护作用及其可能机制。方法：96只近交系大鼠随机分为等基因肝移植组（G1）、同种异体肝移植组（G2）、AAV空载体组（G3）和PD—L1转染组（G4），每组12对。通过大鼠肝移植急性排斥模型，将PD—L1-AAV2-RFP（RFP）经门静脉灌注夹闭法转染供肝，观察移植后大鼠中位生存时间（MST），全自动生化分析仪测定肝功能，在荧光显微镜、光镜同视野下观察RFP在移植肝的表达和病理变化。采用免疫组织化学染色法评估PD—L1蛋白的表达及炎性细胞浸润情况。结果：G1在观察期内全部存活；G2与G3MST分别为18（17-20）d和18（17-19）d；G4显著延长了移植肝的存活（MST29d，P〈0．05）。术后14dG4的肝功能及病理变化与术后7dG2和G3相似。G3、G4术后7d中观察到明显的红色荧光，随时间逐渐增强。移植肝PD—L1蛋白的变化趋势与RFP的表达相似。G1移植肝T细胞含量极少；术后14dG2、G3移植肝CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋不同程度淋巴细胞浸润，G4移植肝T淋巴细胞浸润明显减少，尤以CD8^＋细胞为著，与各组相比差异显著（P〈0．05）。结论：腺相关病毒介导的PD—L1基因转染可延长移植肝的存活，其机制可能是PD—L1基因转染增强了PD—L1／PD-1信号通路，通过抑制移植肝CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋T细胞浸润及其功能，从而发挥对移植肝的保护作用。
- 邵永王槐志董家鸿王曙光别平李晓武张玉君陈永文倪斌
- 关键词：腺相关病毒基因转染近交系大鼠
- PD-L1分子与疾病免疫调节被引量：10
- 2008年
- PD-L1(曾命名为B7-H1)是迄今发现的B7家族中较新的共刺激分子,与T细胞上的配体(PD-1)结合后可调节T细胞的活化及分化。它通过激活初始T细胞、抑制活化的效应T细胞及调节细胞因子的分泌等而参与多种免疫过程。以PD-L1为靶点的免疫调节与动物器官移植排斥反应、自身免疫性疾病、慢性病毒感染、肿瘤免疫逃逸等疾病的发生、发展密切相关。本文就PD-L1在上述疾病中发生、发展及治疗中的作用做一综述。
- 邵永王槐志董家鸿
- 关键词：PD-L1PD-1免疫调节
- 改良的肝脏移植流出道重建术被引量：4
- 2005年
- 目的 总结我院肝移植时应用改良的肝脏流出道重建方式的经验。方法 回顾性分析我院14 2例肝移植时肝脏流出道重建方式的改良及其效果。结果 本组肝移植病例14 2例中手术死亡16例,手术死亡率为11 2 7%。无肝脏流出道梗阻。2例存活超过4年,5例存活超过3年,34例存活超过2年,38例存活超过1年。结论 改良的肝脏流出道重建方式有利于减少技术性并发症。
- 王槐志董家鸿王曙光别平蔡景修何宇卢倩
- 关键词：肝脏移植重建术手术死亡率手术时间存活
- 重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达
- 2006年
- 目的克隆人DcR3基因于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体pAAV-IRES-hrGFP中,以获得高感染滴度及纯度的重组人DcR3腺相关病毒,为将其用于感染移植肝,研究其对大鼠移植肝的保护作用打下基础。方法用基因重组的方法构建含全长人DcR3基因的重组腺相关病毒骨架质粒,利用脂质体法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞AAV-293细胞中,合成重组DcR3腺相关病毒,经PEG/氯仿纯化,用SDS-PAGE鉴定其纯度,扫描电镜观察病毒颗粒形态,倍比稀释法测定重组病毒的感染滴度。并用重组病毒感染COS-7细胞鉴定DcR3的表达。结果正确构建组装重组人DcR3腺相关病毒,纯化后病毒感染滴度为1.1×1010U/mL。在重组DcR3腺相关病毒感染的COS-7细胞上清液中检测到了DcR3的表达。结论成功构建了重组人DcR3腺相关病毒,为下一步研究DcR3对大鼠移植肝的保护作用打下基础。
- 王槐志黎万玲董家鸿倪兵吴玉章
- 关键词：基因DCR3腺相关病毒
- 诱骗受体3分子研究进展被引量：2
- 2007年
- 1998年Piui等通过搜索表达标签数据库，在原发性肺和结肠肿瘤中发现并克隆表达了一个可溶性的受体，命名为诱骗受体3（decoy receptor3，DcR3），又称为肿瘤坏死因子受体6（tumor necrosis facwr receptor6，TR6）或M68。DcR3属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族的成员，其开放阅读框编码300个氨基酸（包括29个氨基酸残基组成的信号肽），但没有跨膜区，是一个分泌性的蛋白。
- 王槐志董家鸿
- 关键词：受体3肿瘤坏死因子受体分子开放阅读框克隆表达
- 诱骗受体3对大鼠移植肝脏的保护作用被引量：2
- 2007年
- 目的将重组诱骗受体3（decoy receptor 3，DcR3）腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）感染移植肝，探讨DcR3对移植肝的保护作用。方法实验动物分为同基因肝移植组（G1）、同种异体肝移植组（G2）、AAV空病毒感染的同种异体肝移植组（G3）、重组DcR3／AAV感染的同种异体肝移植组（G4）。常规建立同种异体大鼠肝移植模型；术中取预先制备的浓缩1×10^9IU病毒颗粒感染移植肝；术后观察大鼠的存活时间、肝功能，荧光显微镜及光镜下观察DcR3在肝脏中的表达及肝脏病理改变。结果G4组的平均生存时间比G2、G3组显著延长，G2、G3组的平均生存时间差异无统计学意义。G4组大鼠术后15、20d的肝功能、肝脏病理改变分别与G2、G3组大鼠术后7、10d相似。结论DcR3对大鼠移植肝有显著的保护作用。
- 王槐志黎万玲张玉君陈志宇朱瑾郑平熊燕董家鸿
- 关键词：诱骗受体3肝移植
