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E1A激活基因阻遏子表达与小鼠胚胎血管发生的关系被引量：1: 2007年; 目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)蛋白表达与小鼠动脉形态学发生的关系,了解CREG蛋白在血管发育中的生物学作用。方法制备E9.5d-E18.5d胎鼠、新生1d、28d和2月成鼠不同脏器功能血管的石蜡组织切片,观察主动脉发生过程中的形态学变化;采用免疫组化染色法观察不同发育时相的血管细胞中CREG蛋白和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)标记物肌动蛋白(SMα-actin)的表达变化。结果HE染色显示E9.5d的胚胎血管由单层血管内皮细胞构成,免疫组化显示CREG表达阳性,主要定位于血管壁的单层内皮细胞中,SMα-actin表达为阴性;E10.5d的胚胎血管内皮细胞周围开始出现少量SMα-actin表达阳性的原始VSMCs,同时CREG蛋白表达,定位与SMα-ac-tin蛋白一致。自E12.5d开始SMα-actin蛋白在血管中膜VSMCs中表达增强并持续至成年。CREG蛋白在三层结构的血管细胞中均为阳性表达,其表达强度在E15.5d达到最高,E18.5d表达下降并维持至成年。进一步分析CREG蛋白在成年鼠心、肺、脾和肾等多个脏器血管中的分布,发现所有脏器血管细胞均表达CREG,但表达丰度明显不同,在储存血管和分配血管中CREG蛋白呈高表达,在调节血管中低表达。结论CREG蛋白在小鼠胚胎血管发育早期、持续表达的特点及其在不同脏器功能血管中表达的差异,提示CREG蛋白可能通过调控并维持血管细胞,特别是VSMCs的分化,参与了胚胎血管发生的调控。; 韩雅玲杨桂棠闫承慧康建; 关键词：阻遏蛋白 E1A 血管发育

人血管细胞中hCREG1基因启动子对血清饥饿发生应答: 2008年; 目的:为揭示E1A激活基因阻遏子(CREG1)在人血管平滑肌细胞(VSMCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达的调控机制,构建人CREG1(hCREG1)启动子报告基因载体,探讨CREG1在不同血管细胞中的表达。方法:在对hCREG1进行生物信息学分析的基础上,以人基因组DNA为模板,PCR方法扩增含有hCREG1基因上游-3677bp序列,构建了hCREG15′上游-3677bp、-2310bp和-945bp序列片段,分别将这3个序列克隆到pMD18-T载体上并定向亚克隆到pEGFP-1报告基因载体-pEGFP-hCREG1-P3677、pEGFP-hCREG1-P2310和pEGFP-hCREG1-P945。将重组质粒瞬时转染VSMCs株HITASY和HUVECs,检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。结果:经测序鉴定证实,3个报告基因载体中插入的PCR扩增序列均与hCREG1基因上游DNA序列完全匹配。瞬时转染体外培养的人VSMCs和HUVECs后,经荧光观察和蛋白质印迹(Western blotting)证实,细胞内存在GFP的表达,并且0.5%FBS培养的HITASY细胞中GFP表达较10%FBS培养的细胞中明显增加。HU-VECs中的GFP表达较人VSMCs明显增加。结论:hCREG1基因启动子报告基因载体构建成功,核心启动子存在于5′上游序列的-945bp-0bp区域,为进一步研究hCREG1基因表达提供了条件。; 韩雅玲赵昕闫承慧康建张效林邓捷徐红梅刘海伟; 关键词：基因

人E1A激活基因阻遏子基因启动子生物信息学分析及转录调控功能初探: 2007年; 目的对人类腺病毒5型早期区域1A(adenovirus type 5 early region 1A,E1A)激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes,hCREG)启动子进行生物信息学分析、预测hCREG启动子位置和转录因子结合位点。方法对2005年1月至7月沈阳军区总医院全军心血管病研究所进行的从Genbank中获得hCREG的全长编码基因,利用First EF程序分析软件分析并获得hCREG的启动子序列,利用Motif软件对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。免疫荧光染色和Western blot分别观察相关转录因子的蛋白表达与细胞内hCREG蛋白及细胞表型转化之间的关系。结果用First EF软件测定长度为945bp的hCREG启动子序列,hCREG的启动子区可能定位于转录起始点上游-109^-359bp。用Motif软件预测启动子区域共含有80多个转录调控因子结合位点,其中肿瘤抑制基因wtp53结合位点为-456bp。进一步应用蛋白质印迹(western blot)和免疫荧光染色分析wtp53与细胞表型转化的关系。在0.5%胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)培养的HITASY细胞wtp53表达较10%FBS培养HITASY细胞明显增加。同时,hCREG蛋白和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-ac-tin亦表达增多。结论获得了hCREG启动子的转录调控信息,推测出wtp53是hCREG基因转录的重要调控因子,它可能结合于hCREG启动子区,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控。; 韩雅玲赵昕闫承慧康建张效林邓捷徐红梅刘海伟; 关键词：启动子 WTP53 阻遏蛋白 E1A

转录因子E2F1抑制CREG表达调控体外培养的人血管平滑肌细胞分化被引量：7: 2007年; 为探讨转录因子E2F1在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化中的作用及其对E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)表达调控的分子机制,应用生物信息学方法,定位人CREG(hCREG)基因启动子并确定转录因子E2F1在hCREG启动子区的结合位点,PCR方法克隆并构建hCREG基因启动子绿色荧光报告基因载体,以hCREG启动子区E2F1结合位点为模板,化学合成E2F1寡聚脱氧核苷酸(ODN)和错配E2F1ODN,利用转录因子"诱骗(Decoy)"策略,用E2F1ODN转染体外培养的VSMCs以阻断E2F1与hCREG基因启动子区的结合,蛋白质印迹(Western blot)分析检测阻断前后细胞内hCREG蛋白、报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-actin表达变化.结果显示:分化表型HITASY细胞中E2F1表达下调伴出核转位,而增殖表型的HITASY细胞中E2F1蛋白表达明显增加且定位于核内.进一步应用FuGene6瞬时转染E2F1ODN和错配E2F1ODN于体外培养HITASY细胞中,蛋白质印迹分析发现,转染E2F1ODN后,HITASY细胞中hCREG、SMα-actin和GFP表达均较未阻断组及错配组细胞明显增加.上述研究结果证实,E2F1是hCREG基因转录的重要调控因子,能够直接结合于hCREG启动子区阻遏hCREG表达,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控作用.; 韩雅玲赵昕闫承慧康建张效林邓捷徐红梅刘海伟; 关键词：E2F1 阻遏蛋白 E1A 表型血管平滑肌细胞

重组分泌型人CREG/myc-His融合糖蛋白的表达及功能分析被引量：4: 2008年; 目的:构建人E1A激活基因阻遏子(Human cellular repressor of E1A-stimulated gene,hCREG)基因的真核表达载体并转染人293F细胞株,筛选稳定转染细胞克隆,鉴定重组的分泌型hCREG/myc-His融合蛋白的糖基修饰和生物学功能。方法:用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框并构建pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体;Lipofectamine 2 000转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆,去血清法诱导重组蛋白表达;应用Western blot方法鉴定分泌型hCREG/myc-His融合蛋白的表达,糖苷酶法及Western blot行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析;用流式细胞周期分析分泌型hCREG/myc-His融合蛋白对体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)增殖能力的影响。结果:RT-PCR扩增含终止密码突变的hCREGcDNA片段,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切构建了pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体,酶切及测序结果证实构建的重组质粒正确;Western blot证实转染pcDNA4 myc-His/hCREG的293F细胞克隆可以稳定表达并分泌hCREG/myc-His融合蛋白;糖苷酶分析证实分泌型hCREG/myc-His融合蛋白是糖基化蛋白;流式细胞周期分析证实与正常培养HITASY细胞比较,添加含有分泌型hCREG/myc-His糖蛋白上清的HITASY细胞出现明显的G1期细胞周期阻滞现象(58.88%vs 62.89%,P<0.005)。结论:构建了pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体并表达了具有生物学功能的分泌型重组hCREG/myc-His糖蛋白。; 韩雅玲孙鸣宇郭亮郭鹏栾波康建闫承慧; 关键词：真核表达载体糖蛋白

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国家自然科学基金(30570664)

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