国家科技重大专项(2008ZX10003003-02)
- 作品数：8 被引量：35H指数：3
- 相关作者：胡忠义刘忠华杨华丁元生秦莲花更多>>
- 相关机构：上海市肺科医院苏州大学中国兵器工业集团更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项上海市科学技术委员会科研基金中国科学院知识创新工程更多>>
- 相关领域：医药卫生自动化与计算机技术更多>>
- 结核分枝杆菌重组蛋白Rv0222的表达及血清学鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的构建Mtb重组蛋白Rv0222的重组质粒,评价其用于结核病血清学诊断的价值。方法通过PCR从Mtb染色体基因组中扩增出Rv0222基因片段,插入pMD18-T载体后,再亚克隆入表达载体pET30a中,诱导表达重组菌,组氨酸标签(His-tag)亲和层析纯化蛋白,通过免疫印迹法分析重组蛋白的免疫反应性,通过间接ELISA方法检测142例血清样本,来自82例结核病患者(痰涂片或痰培养阳性,抗结核治疗症状减轻者),28例非结核病患者(8例肺癌、15例肺炎和5例肺气肿)和32例健康体检者,检测数据通过专业医学软件MedCalc 11.5.0分析ROC曲线下面积和最佳阳性判定值。结果成功构建重组载体,重组蛋白Rv0222经电泳后显示相对分子质量约为27 000,镍柱纯化后蛋白纯度达95%以上,通过蛋白免疫印迹法证实重组蛋白Rv0222与结核病患者血清能特异性结合。酶联免疫检测ROC曲线下面积为0.893,最佳阳性判定值为0.12时,结核病患者组抗体检测敏感度为69.5%(57/82),非结核病患者和健康体检者抗体检测特异度为90.0%(54/60),结核病患者与非结核病患者及健康体检者相比,差异有统计学意义(t=25.78,P<0.0001)。结论成功构建pET30a-Rv0222表达载体,获得高纯度的重组蛋白Rv0222,ELISA结果显示Rv0222蛋白有望成为结核病血清学诊断的有效抗原之一。
- 王庆杨华金瑞良胡忠义刘忠华
- 关键词：重组蛋白质类细菌蛋白质类酶联免疫吸附测定
- 结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-CFP21融合蛋白克隆表达及全血IFN-γ的检测被引量：1
- 2010年
- 目的构建结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6-CFP21(CE21)融合蛋白的重组质粒,通过IFN-γ的检测探讨CE21在结核病检测中的价值。方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得CFP21和CFP10-ESAT-6(CE)基因片段,分别连接到pMD18-T,并将两片段2次连接到表达载体pET21a(+)中,获得pET21a-CFP10-ESAT-6-CFP21重组质粒;经表达纯化和复性后,去除内毒素,利用酶联免疫吸附试验检测48例结核病患者、30例非结核肺部疾病患者及32例健康对照者全血中IFN-γ的释放量。结果CE21经SDS-PAGE分析后相对分子质量为45,与预期大小一致。CE21融合蛋白全血标本IFN-γ的检测,结核组阳性率为72.9%,非结核疾病对照组和健康对照组阳性率分别为3.3%和3.1%。结论成功获得CE21融合蛋白,IFN-γ的检测证明该融合抗原具有良好的结核病检测价值。
- 周舟丁元生刘忠华毛翎桂徐蔚胡忠义
- 关键词：分枝杆菌结核重组融合蛋白质类
- 分泌蛋白MPT64鉴定结核分枝杆菌复合群的应用研究被引量：9
- 2009年
- 目的构建重组MTB分泌蛋白MPT64，制备多克隆抗体，评价其在鉴定MTB复合群中的应用价值。方法通过PCR扩增mpt64基因，构建pET21a—mpt64重组质粒；纯化重组蛋白并免疫兔制备多克隆抗体；纯化和标记抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）方法；检测分枝杆菌标准菌株和临床分离株培养液中MPT64蛋白，抽提样本基因组扩增mpt64基因。结果成功构建重组质粒，纯化重组蛋白并制备多克隆抗体，检测抗体浓度为0．85g／L，ELISA法检测敏感度为0．01mg／L，MTB复合群中H37Rv、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌为阳性，24株非MTB均为阴性；rapt64基因扩增的结果与ELISA法检测结果完全相符。ELISA法检测MTB临床分离株的敏感度为97．3％（110／113），57株非MTB均未检出MPT64蛋白，检测特异度为100．0％。基因扩增MTB中2株为阴性，非MTB均为阴性。结论采用ELISA法检测分泌蛋白MPT64来鉴定MTB复合群，是一种准确、快速和简便的方法，值得临床推广应用。
- 刘忠华秦莲花冯永红毕爱笑杨华丁元生崔振玲金瑞良郑瑞娟胡忠义
- 关键词：分枝杆菌结核分泌蛋白
- MPT64抗体的适体在结核病血清学检测中的应用被引量：3
- 2010年
- 目的 利用SELEX技术筛选MPT64抗体的适体建立混合夹心ELISA检测体系,应用于临床血清标本的检测,探讨该方法 潜在的实验室诊断价值.方法 利用竞争ELISA检测方法 ,测定不同浓度的MPT64抗原对最后一轮ssDNA文库与靶物质亲和力的抑制率,选取优势序列且亲和性值较高的适体用于检测,优化混合夹心ELISA检测方法 ,确定MPT64抗体的检测下限和线性范围,同时检测230例临床血清标本.结果 在竞争ELISA结果 中,总反应体系为100μl,MPT64抗原浓度由2μg/ml增加到256 μg/ml时,对ssDNA文库的抑制率也由0.25%增加到80%.优化的混合夹心ELISA的检测体系：ssDNA包被浓度为0.1μg/孔、血清稀释度为1/200、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体浓度为1/40 000.MPT64抗体的检测下限为3 mg/L,线性范围为10～1000 mg/L.利用该体系检测100例结核病患者、100例健康体检者和30例非结核病患者血清,检测结果 用GraphpadPrism软件进行分析,结核病组与健康体检组、结核病组与非结核疾病对照组差异均具有统计学意义（P〈0.001）.统计学分析得到检测的特异性与敏感性分别为96.1%和31.0%.结论 利用适体建立的混合夹心ELISA用于结核病的血清学诊断具有一定的诊断价值.
- 蔡江丽秦莲花刘忠华王洁胡忠义
- 关键词：SELEX适体SSDNA血清学检测
- 寡核苷酸法检测结核病患者血清IgG抗体的临床应用评价
- 2011年
- 目的评价结核分枝杆菌IgG抗体寡核苷酸酶联免疫法在结核病血清学诊断中的临床应用价值。方法对285例结核病[菌阳肺结核(涂片阳性/培养阳性)124例,菌阴肺结核(涂片、培养均为阴性)161例]、38例非结核病的其他呼吸系统疾病患者及49名健康志愿者同步进行抗酸杆菌涂片、培养及结核分枝杆菌IgG抗体寡核苷酸酶联免疫法检测。结果结核分枝杆菌IgG抗体寡核苷酸酶联免疫法诊断菌阳肺结核的敏感性为67.7%(84/124),诊断菌阴肺结核的敏感性为33.5%(54/161),诊断结核病的总体敏感性为48.4%(138/285),总体特异性为92.0%(80/87),其中在非结核病的其他呼吸系统疾病患者中的特异性为86.8%(33/38),在健康志愿者中的特异性为95.9%(47/49)。结论结核分枝杆菌IgG抗体寡核苷酸酶联免疫法有极高的特异性和一定的敏感性,可用于结核分枝杆菌IgG抗体的血清学检测,能为临床诊断提供可靠的参考依据。
- 徐园红岳冀秦莲花罗槑贺建兰李青峰胡忠义
- 关键词：IGG抗体血清学检测
- 结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值被引量：11
- 2009年
- 目的构建重组结核分枝杆菌38 kD-16 kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16 kD和38 kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段2次连接到表达载体pET21a中,形成38 kD-16 kD(3 816),16 kD,38 kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65 kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。
- 刘忠华丁元生毕爱笑冯永红金瑞良杨华秦莲花胡忠义
- 关键词：重组融合蛋白质类血清学试验
- 光学生物传感器用于快速检测卡介苗活菌数研究被引量：7
- 2010年
- 基于三磷酸腺苷(ATP)光学反应原理,结合实验室自制的光学生物传感器,构建了一种快速检测卡介苗(BCG)活菌数的方法。选用加热裂解法提取BCG活菌内ATP,对BCG疫苗进行了检测。结果表明,BCG活菌浓度与相对发光强度(RLU)线性相关,相关系数为0.9908(P<0.01),其ATP含量与文献报道的结果处于同一数量级(10-18mol/CFU)。检测方法的相对标准偏差(RSD)为6.17%。检测样品仅需30μL,检测时间小于30min。与国外商业化检测系统的测试结果线性相关,相关系数为0.9676(P<0.01)。这种方法简便快速,在BCG疫苗及其他活菌疫苗质量控制方面具有广泛的应用前景。
- 刘晓红赵爱华罗金平高从军田青王国治蔡新霞
- 关键词：BCG
- 结核分枝杆菌19kD-ESAT6融合蛋白的克隆表达及纯化被引量：3
- 2009年
- 运用聚合酶链反应(PCR)技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv中扩增获得19kD脂蛋白和esat-6基因片段,将目的片段分别克隆到pMD18-T载体,再亚克隆目的片段到同一表达载体pET-21a,构建重组表达载体pET21a-19kD-ESAT6,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),表达纯化后用蛋白质印迹法(Western blot)分析其抗原反应性。结果成功构建了重组质粒pET21a-19kD-ESAT6,并在大肠埃希菌中获得高效表达。SDS-PAGE结果显示,在相对分子质量(Mr)约29×103处有表达条带。Western blot结果表明,重组蛋白19kD-ESAT6与确诊的结核病患者血清发生特异性免疫反应,具有特异的抗原性。本研究构建的结核分枝杆菌19kD-ESAT6融合蛋白为结核病血清学诊断试剂的开发提供了依据。
- 拾莉丁元生杨华刘耀婷刘忠华胡忠义黄瑞
- 关键词：结核分枝杆菌融合蛋白
