教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-07-0336)
- 作品数：12 被引量：46H指数：4
- 相关作者：闫云君汪小锋杨江科贾彬徐莉更多>>
- 相关机构：华中科技大学通标标准技术服务有限公司武汉大学更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”国家高技术研究发展计划武汉市科技攻关计划项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程轻工技术与工程更多>>
- 解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质被引量：3
- 2011年
- 【目的】克隆解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶LIP4和LIP5的cDNA序列,研究其基因结构,并实现其在毕赤酵母中的功能表达,以探讨其酶学性质。【方法】利用反转录PCR首次扩增LIP4和LIP5的编码基因,用SignalP 3.0分析其基因序列,然后分别构建胞内表达载体pPIC3.5K-Lip4、pPIC3.5K-Lip5和胞外表达载体pPIC9K-Lip4、pPIC9K-Lip5,将其转入毕赤酵母GS115中表达,以NTA树脂纯化酶蛋白,研究其酶学性质。【结果】cDNA序列测序结果显示两者均不含内含子,酶蛋白的氨基酸序列中含有典型脂肪酶的活性三联体结构和五肽保守区;酶学性质研究表明,两者的最适底物均为癸酸(C8)对硝基苯酚酯,最适pH为7.0,最适温度为40℃,但LIP4对pH和温度更敏感;两者均能被Ca2+激活,且LIP5还能为Mg2+激活,但均被Hg2+、乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)强烈抑制。【结论】首次克隆了解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5编码基因,实现了其在毕赤酵母中的活性表达,并初步研究了其酶学性质,为上述脂肪酶的应用及进一步深入研究解脂耶氏酵母脂肪酶家族奠定了基础。
- 赵鹤云肖潇徐莉刘云闫云君
- 关键词：解脂耶氏酵母酶学性质
- 基于BP神经网络的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶发酵软测量建模被引量：2
- 2010年
- 为建立洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶发酵过程的软测量模型,运用BP神经网络对洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的发酵过程进行软测量建模,并利用遗传算法对神经网络的初始权值和阈值进行优化,实现模型加快收敛速度,达到全局最优解效果。该模型能够比较精确地模拟菌体生长、底物消耗以及发酵产酶的过程动态,具有良好的泛化能力,说明BP神经网络结合遗传算法在洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶发酵过程的模拟与预测中是一种高效快速的方法。
- 汪小锋付强申旭光杨江科闫云君
- 关键词：BP神经网络遗传算法发酵
- 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶:一种应用前景广阔的生物催化剂被引量：7
- 2009年
- 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶对有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等具有良好的抗性,在有机合成、对映体拆分、非水相催化等领域应用十分广泛。综述了洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的发酵生产、分离纯化、基因克隆与表达、固定化与生物印迹、蛋白质结构解析及应用研究等,并展望了其未来发展方向,以期为该工业酶的研发与广泛应用提供参考。
- 汪小锋贾彬刘涛杨江科闫云君
- 关键词：分离纯化固定化蛋白质结构
- 土壤中产脂肪酶洋葱伯克霍尔德菌的分离与鉴定被引量：3
- 2010年
- 洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)在生物防治、生物降解等农业领域有着广泛的应用,它产生的脂肪酶则在有机合成、精细化工等领域潜力巨大。采用改良的TB-T平板筛选法从土壤中初步筛选出300株洋葱伯克霍尔德菌,然后用脂肪酶活性检测平板对300株菌进行筛选,最终获得6株脂肪酶产量高的菌,通过发酵发现6株菌均有较好的产脂肪酶能力。随后通过16S rDNA比对的方法将6株全部鉴定为B.cepacia。在此基础上,采用HaeⅢ-recA RFLP和基因种特异性PCR对6株菌进行了基因种鉴定,结果表明JWT16、G63YL、WJ158和JWT137属于Burkholderia cenocepacia菌,JWP9属于Burkhold-eria vietnamiensis,JWT267则属于Burkholderia multivorans。
- 贾彬刘文山杨江科汪小锋叶才伟闫云君
- 关键词：洋葱伯克霍尔德菌
- 血三七活性部位特征图谱被引量：5
- 2010年
- 目的:建立血三七药材特征图谱,为科学评价血三七质量提供依据。方法:采用高效液相色谱技术,选择Diamonsil TM C18柱(250mm×4.6mm,5μm),以甲醇-0.2%磷酸为流动相梯度洗脱,流速1mL·min-l,检测波长347nm,柱温为室温。结果:建立了9个不同产地血三七黄酮类成分的指纹图谱,发现了11个共有峰,确定了其相对保留时间和相对峰面积的比值范围,每个产地血三七指纹图谱相似度均在90%以上,但也存在一定差异。结论:利用该特征图谱,可以对不同产地血三七药材进行质量控制。
- 向梅先杜小青徐宗闫云君
- 关键词：活性部位黄酮类成分
- 解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的表面展示及其酶学性质被引量：1
- 2010年
- 表面展示酶作为全细胞催化剂具备诸如能提高酶的稳定性、省去纯化过程、节约成本等优点。脂肪酶是应用最为广泛的工业酶之一。本研究利用酿酒酵母细胞壁蛋白Cwp2作为锚定蛋白,将解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2展示在酿酒酵母细胞表面,以制备脂肪酶全细胞催化剂。Lip2被融合到Cwp2的N端,Cwp2通过其C端的GPI锚定信号共价结合到细胞壁上。表面展示的Lip2可以水解三丁酸甘油酯及对硝基苯酚辛酸酯(pNPC),其pNPC水解酶活达到4.6U/g干细胞。作为全细胞催化剂,表面展示的Lip2具备良好的催化特征,其最适温度为40°C,最适pH为8.0,同时还具备良好的有机溶剂稳定性。
- 刘文山赵鹤云贾彬徐莉闫云君
- 关键词：脂肪酶解脂耶氏酵母酿酒酵母
- 解脂耶氏酵母新型表达载体构建及癌基因rho在其中的表达被引量：1
- 2011年
- 为了简化解脂耶氏酵母表达载体构建过程、消除抗生素污染,将mel基因(编码酪氨酸酶)作为新型报告基因用于构建新型酵母表达载体,利用组装PCR人工合成基因mel,并用重叠PCR将其与同源组成型强启动子pTEF、分泌性信号肽XPR2pre及强终止区LIP2t融合,构建新型胞外及胞内表达载体,并利用其在解脂耶氏酵母野生菌株中表达人源癌基因rho。成功获得mel全基因并将其与启动子、信号肽和终止区融合,得到融合片段TXML,用其替换原有表达载体的筛选标记基因ura3d4,构建得到新型胞外及胞内表达载体pINA1297-M和pINA1297-a-M,转化后的酵母阳性转化子性状明显,随后利用此新型表达系统获得可溶性异源蛋白Rho。首次实现了将mel作为一种便捷、价廉、无污染的新型筛选标记基因运用于非常规酵母表达系统中,更为mel在其它真核表达系统中的运用奠定了技术基础;获得的可溶性Rho蛋白可为研究其性质、结构、功能及与Rho癌基因家族其它成员的相互作用提供条件。
- 赵鹤云汪小锋潘小幸刘云徐莉闫云君
- 关键词：解脂耶氏酵母抗生素污染
- 基于T7表达系统的洋葱伯克霍尔德菌G63脂肪酶同源高效表达被引量：4
- 2009年
- 为实现对洋葱伯克霍尔脂肪酶的可控高效表达,将目前被广泛使用的T7重组蛋白高效表达系统移植到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)G63中进行脂肪酶同源表达。首先采用PCR从大肠杆菌BL21(DE3)中得到T7 RNA聚合酶基因(T7 RNAP)并将其克隆到致死质粒pJQ200SK上,然后在T7 RNAP前后各加入500 bp用于同源重组的片段,再通过三亲本杂交把T7 RNAP整合到B.cepacia基因组上,使T7 RNAP受到脂肪酶基因(lipA)启动子调控。接着把lipA和它的伴侣基因lipB单独或全部克隆到载体pUCPCM和pBBR22b上,构建出pBBR22blipAB、pBBR22blipA、pUCPCMlipAB、pUCPCMlipA、pUCPCM△lipAlipB、pUCPCM△lipA、pUCPCM△lipB七种表达质粒,通过电转化将上述表达质粒转化到含T7 RNAP的B.cepacia宿主菌中,最终得到一系列脂肪酶基因工程菌。通过摇瓶诱导发酵发现含表达质粒pUCPCMlipAB的工程菌脂肪酶酶活最高,达到607 U/mg,与野生菌相比酶活力提高2.8倍,并且除含pUCPCM△lipB的工程菌外,其它工程菌的脂肪酶酶活均有不同程度提高。野生菌与工程菌pUCPCMlipAB的发酵液经硫酸铵沉淀,Sephadex G-75凝胶过滤纯化后,比酶活分别为29 984 U/mg和30 875 U/mg。以上结果表明,构建的基于T7表达系统的B.cepacia脂肪酶基因工程能有效提高脂肪酶的表达量,同时说明分泌信号PelB和增强转录的核糖体接合位点对脂肪酶的表达有促进作用。
- 贾彬杨江科闫云君
- 响应面法优化洋葱伯克霍尔德菌固定化脂肪酶催化合成生物柴油工艺被引量：4
- 2009年
- 以自制的洋葱伯克霍尔德菌固定化脂肪酶为催化剂,在微水相、无溶剂体系中研究了大豆油和甲醇合成生物柴油的工艺。在系统考察了酶用量、醇油比、含水量、反应温度、反应时间、甲醇流加方式等因素对甲酯得率影响的基础上,利用响应面试验设计优化了各主效因子,建立甲酯得率的二次回归方程,获得了最优的工艺条件:加酶量2.4%、加水量7.1%、反应温度40.4℃、反应时间10.7 h、醇油比4.5。在此条件下,实验测得甲酯得率为97.2%,与响应面模型预测值96.9%非常吻合,说明该优化方法有效、可靠。
- 李相刘涛杨江科
- 关键词：洋葱伯克霍尔德菌固定化脂肪酶生物柴油响应面设计
- 固态发酵生产微生物脂肪酶被引量：4
- 2009年
- 脂肪酶在水相和非水相中都具有催化活性,在众多工业领域应用前景十分广阔。但脂肪酶的生产成本仍然过高,限制了其在某些工业领域的大规模使用。固体发酵因具有设备比较简单、能耗低、成本低、对环境危害小、易于推广等诸多优点,已逐渐成为微生物脂肪酶生产的一个重要方式。由于能源成本的抬高和人们环保意识的加强,自上世纪90年代以来,原来一直认为技术含量较低的固态发酵技术重新受到重视并得到了快速的发展。综述了固态发酵在脂肪酶生产中的应用研究,重点介绍了固态发酵生产脂肪酶的特点、脂肪酶固态发酵的影响因素及其生物反应器。
- 汪小锋闫云君
- 关键词：固态发酵脂肪酶基质生物反应器
