国家自然科学基金(30970632)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 定向进化法提高嗜热酯酶对长链酰基酯的选择性
- 2011年
- 目的提高嗜热酯酶对长链酰基酯的选择性,并分析该酶的底物选择性与酶结构的关系。方法应用定向进化法,对APE1547突变体P01(APE1547/R526V)的催化结构域基因进行易错PCR后,与推进器结构域连接,转化大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL,在双重选择压力下(高温及活性测定),应用高通量筛选方法筛选突变体,并针对特定的突变位点进行进一步饱和突变筛选,得到对长链酰基酯底物pNP-C12选择性提高的突变体酶。通过热稳定性测定、催化动力学分析和分子动力学模拟分析突变对酶结构和功能的影响。结果从近万个随机突变体库中筛选到3株优势突变体,经测序得到4个氨基酸突变位点(379、394、489和560);对4个位点氨基酸分别进行饱和突变筛选,得到活性最高的突变体E01(APE1547/R526V/T560W),在80℃,P01和E01的半衰期分别为123和77 h;催化长链酰基酯底物pNPC-12的效率(kcat/Km)提高约14倍。分子动力学模拟分析表明,560位点突变可能阻碍底物pNP-C12沿次要通道进入酶分子内部。结论定向进化结合饱和突变的方法可有效提高嗜热酯酶对长链酰基酯底物的活性和选择性;嗜热酯酶APE1547内部的底物交通对酶的底物选择性具有重要影响,E01突变体通过显著改善pNP-C12在酶内部的底物交通提高了对pNP-C12的选择性,并对酶分子的稳定性有较大影响。
- 刘畅田国贺郑柏松张作明冯雁
- 催化元件和途径的人工设计与组装被引量：1
- 2011年
- 催化元件以及由多个催化元件组成的合成途径的设计与组装为人工合成体系的建立奠定了基础,是合成生物学的重要研究内容。除从自然生物中挖掘大量的天然酶和途径可供人工合成体系使用外,将计算生物学、蛋白质工程以及组合生物合成等技术相结合,理性地、有目的地进行催化元件和途径的人工设计与组装,将提供新功能酶以及新物质合成途径。介绍了催化元件和合成途径人工设计与组装的研究策略和最新进展。
- 韩云宾黄琛冯雁
- 关键词：合成生物学
