国家自然科学基金(30200176)
- 作品数：25 被引量：209H指数：11
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- 相关机构：南开大学云南大学天津中医学院更多>>
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- 相关领域：生物学农业科学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列被引量：12
- 2006年
- 用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As3.2806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。
- 王德培孙伟李明春魏东盛张颖慧邢来君
- 少根根霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达被引量：17
- 2006年
- 【目的】验证少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况,为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础。【方法】将少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接,构建重组表达质粒pCPNRAD6,采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法,将该基因导入甘蓝型油菜H165,获得转基因植株,最后通过气相色谱检测基因的表达情况。【结果】PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明,目的基因已经整合到油菜基因组中,Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达,气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,证明目的基因获得功能表达。同样,用改变少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有提高。【结论】初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系。
- 张琦李明春蔡易苗翠苹李绍兰陈有为邢来君
- 关键词：少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因油菜Γ-亚麻酸
- 改良大豆子叶节再生体系的研究被引量：22
- 2006年
- 采用大豆种子萌发5—6d后的子叶节作外植体，对农杆菌介导的大豆遗传转化系统及其影响因素进行r研究。结果表明，将子叶节与农杆菌共培养60h后放入含卡那霉素50mg／L的诱芽培养基上，待苗长至4-5cm后放入生根培养基中进行生根，最后移栽到培养土中，效果较好。对大豆遗传转化再生的主要因素，如大豆基因型、诱导出芽所需激素浓度、卡那霉素筛选压力等条件做了一系列的研究，建立了一个比较好的遗传转化系统，其转化率达到2．8％。
- 李明春蔡易赵桂兰财音青格乐周皓孙伟邢来君
- 关键词：大豆子叶节转基因植株
- 向大豆导入深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的初步研究被引量：8
- 2003年
- 通过农杆菌介导法 ,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉育 4 3、黑农36、黑农 37等品种。采用多种外植体和感染方法 ,从子叶节和胚轴诱导出丛生芽与再生植株。经过在含 5 0mg L卡那霉素的筛选培养基中连续筛选 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分析 ,初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中。
- 卜云萍李明春胡国武王广科邢来君
- 关键词：大豆深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶农杆菌介导法转基因植株
- 少根根霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达被引量：12
- 2004年
- 根据真菌Δ6 脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT PCR ,获得一个 5 93bp的cDNA片段 ,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物 ,通过cDNA末端扩增技术 (RACE)获得该cDNA的 3′和 5′序列 ,从而得到全长为 14 82bp的cDNA序列。序列分析结果表明 ,该序列具有一个长度为 1377bp、编码 4 5 8个氨基酸的开放阅读框 ,所编码蛋白质的大小为 5 2kD。与报道的Δ6 脂肪酸脱氢酶一样 ,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的 3个组氨酸保守区和疏水结构 ,在其氨基酸序列的N 末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区。该序列为一个新的编码Δ6 脂肪酸脱氢酶的基因 ,为了验证其功能 ,把开放阅读框序列RAD6亚克隆到表达载体 pYES2 0 ,构建重组表达载体pYRAD6 ,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱 /质谱 (GC MS)分析表明 ,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的酶具有Δ6 脂肪酸脱氢酶活性 ,能将外源性的底物亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 3 85 %。
- 张琦李明春孙颖马海庭任勇邢来君
- 关键词：少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶Γ-亚麻酸酿酒酵母
- 转基因烟草表达高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的研究被引量：9
- 2004年
- 将高山被孢霉ATCC16 2 6 6Δ6 脂肪酸脱氢酶 (D6D)基因亚克隆到植物表达载体pBI12 1中 ,构建了CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pBMACL6。经根癌农杆菌LBA4 4 0 4的介导 ,采用叶盘法转化烟草Xanthi,得到一批转基因烟草植株。转基因植株的PCR和Southernblot分析表明 ,D6D基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸GC分析表明 ,与未转基因的烟草苗对照相比 ,转基因植株有D6D基因目标产物γ 亚麻酸的产生 ,说明高山被孢霉的D6D基因在烟草中得到了表达。
- 李明春刘莉胡国武财音青格乐邢来君
- 关键词：转基因烟草Γ-亚麻酸油料作物
- Δ~6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好被引量：5
- 2004年
- 添加α 亚麻酸作为底物 ,经半乳糖诱导 ,在含有少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成 ;同时添加亚油酸和α 亚麻酸时 ,检测到γ 亚麻酸和十八碳四烯酸生成 ,而且十八碳四烯酸的含量是γ 亚麻酸含量的 3 81倍 ,表明在酿酒酵母中少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶不仅能催化α 亚麻酸生成十八碳四烯酸 ,而且偏好n 3途径中的底物α 亚麻酸。同样 ,在改变少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母中 ,也得到类似的结果 。
- 张琦李明春孙颖任勇孙红妍马海庭邢来君
- 关键词：少根根霉酿酒酵母Γ-亚麻酸偏好
- 大豆种子特异性启动子的克隆及序列分析被引量：21
- 2005年
- 通过PCR技术从大豆品种吉林 4 3基因组DNA中分离到大豆β 伴球蛋白α 亚基基因启动子片段 (BCSP4 89) ,对此片段采用TAILPCR技术进一步延伸 ,获得了启动子片段BCSP6 6 6。序列分析表明 ,在启动子片段BCSP6 6 6中含有多种种子特异性启动子所特有的序列元件 ,如A T富含序列元件、RY重复序列元件、AGCCCA序列元件、TACACAT序列元件、ACGT序列元件、E盒等。据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。以该片段构建种子特异性表达载体pBI12 1 6 6 6 ,以FloralDip方法转化拟南芥 ,转基因拟南芥中的GUS酶荧光光度分析和组织化学检测均表明 ,GUS基因在启动子片段BCSP6 6 6调控下获得了种子特异性表达。
- 财音青格乐李明春蔡易陶然邢来君
- 关键词：TAILPCR
- 高山被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达被引量：7
- 2004年
- 将从高山被孢霉中克隆的△6-脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI121连接,构建了重组质粒pBMICL6,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将该基因导入到栽培大豆吉林35、吉林43、吉林47、绥农10、绥农14和黑农37等品种中,获得了一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明,该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。通过气相色谱(GC-MS)对大豆种子进行脂肪酸成分分析,发现转基因大豆产生了γ-亚麻酸,其含量最高可达25.165％。
- 卜云萍李明春胡国武邢来君
- 关键词：高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶大豆基因表达
- 以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化被引量：18
- 2007年
- 利用亚硝基胍（MNNG）诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法,将含有E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体,并在潮霉素B浓度为400μg/mL的选择培养基上筛选转化子,获得了1.6~2.8个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性实验表明,质粒线性化后所获得的转化子在PDA培养基上传代10代以后,转接到选择平板上有31.6%仍具有HmB抗性;随机挑选了3个转化子,通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在,Southern杂交发现,潮霉素抗性基因已经以1-2拷贝数整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上,这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。
- 张学炜王笑梅李明春魏东盛陈雪邢来君
- 关键词：深黄被孢霉潮霉素抗性原生质体
