国家自然科学基金(31000371)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 人己糖胺酶D的原核表达、纯化及酶学特性研究被引量：1
- 2012年
- 糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,参与生物体中的信号传导、细胞识别等多种细胞活动,糖基缀合物的正常水解是生物体代谢的必需途径。人己糖胺酶D(Hexosaminidase D)是新发现的一种存在于人细胞质中的切除GalNAc糖基化修饰的外切酶,但该酶的酶学特性尚不清楚。利用PCR的方法,将Hex D的cDNA序列构建到质粒pET3C中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后,通过优化异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度(0.1 mmol/L)和诱导时间(10 h)获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(58 kDa)和纯度(95%以上)。以4-甲基伞形酮-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(4-MU-O-GalNAc)为荧光底物,测定该酶的最适反应pH值为5.5,最适反应温度为37℃,且该酶的热稳定性较好,在50℃下放置半小时仍有较高活性,1mmol/L的金属离子(CuSO4、FeSO4.7H2O、MgCl2.6H2O、CaCl2、NiSO4.6H2O、AlCl3.6H2O、ZnSO4.7H2O、MnCl2)及EDTA对该酶活性影响不大,10mmol/L AlCl3、CuSO、FeSO4.7H2O对该酶有不同程度的抑制。在最适条件下(pH 5.5,37℃)下,该酶的Km为0.16mmol/L,最大反应速率为3.06μmol/(min.mg)。
- 刘琳徐蔡春梅李静蔡玉梅
- 关键词：纯化酶学特性
- OGA糖苷酶酶活中心的鉴定
- 2012年
- N-乙酰葡萄糖胺(O-linkedN-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,参与生物体中的多种细胞活动.O-GlcNAcase(OGA)是生物体内唯一水解蛋白O-GlcNAc修饰的糖苷酶,但该酶的糖苷酶活性中心一直存在争论.实验利用PCR的方法,获得3种不同缺失的人源OGA片段(OGA1:aa1～916;OGA2:aa1～677;OGA3:aa1～350),并将3种片段构建到质粒pET28a中;重组质粒转化大肠杆菌BL21后,进行诱导表达、纯化;以4-甲基伞形酮2-乙酰氨基-2-脱氧葡萄糖为底物测定不同OGA片段的糖苷酶酶学特征常数.结果发现OGA3仍保持糖苷酶的活性,因此OGA的糖苷酶活性中心位于N端1-350aa.
- 李国超徐䶮田高飞李建华李延平冯涛李静
- 关键词：O-GLCNACASE缺失突变酶学特性
