国家自然科学基金(31060351)
- 作品数：9 被引量：21H指数：3
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- 绵羊ISG15基因的克隆表达与纯化被引量：3
- 2013年
- 为了克隆并表达绵羊ISG15,且对其表达产物进行纯化,首先从绵羊外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ISG15的基因;再通过基因克隆技术,构建ISG15在pET28a中的重组表达质粒pET28a-ISG15,在大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,得到ISG15的原核表达蛋白;最后采用Ni 2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白。结果显示:克隆的绵羊ISG15基因序列长度为541bp,编码157个氨基酸。重组表达产物通过SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25ku的重组蛋白,且表达的目的蛋白能被Ni 2+-NTA亲和层析方法所纯化。该研究为后续深入研究绵羊ISG15奠定基础。
- 崔茹鹏沈文鲁海富孙延鸣
- 关键词：绵羊克隆
- 感染肺炎支原体绵羊外周血单核细胞细胞因子和ISG15 mRNA表达水平动态观察被引量：4
- 2014年
- 探讨绵羊感染肺炎支原体后相关细胞因子和干扰素刺激因子15(ISG15)的变化及其意义。应用Real-time PCR方法检测了18只经人工感染肺炎支原体的巴什拜羔羊和盘羊杂交羔羊的外周血单核细胞中IFN-γ、IL-12和ISG15 mRNA的表达水平。结果:在感染后的第7天与第14天,巴什拜羊ISG15的表达量显著高于盘羊杂交羊和对照组(P<0.05);盘羊杂交羊和巴什拜羊的IFN-γ表达水平显著高于对照组(P<0.05);在感染后的第14天,盘羊杂交羊的IL-12表达水平显著高于巴什拜羊(P<0.01)。证实IFN-γ、IL-12和ISG15在肺炎支原体感染过程中起重要作用,对研究支原体肺炎发病机理及提供免疫治疗有指导意义。
- 姜方配沈文鲁海富杨文孙延鸣
- 关键词：绵羊肺炎支原体IL-12
- 新疆野生盘羊ISG15基因的克隆表达被引量：1
- 2013年
- 本研究旨在克隆表达新疆野生盘羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。首先,利用RT-PCR和RACE技术克隆盘羊ISG15基因的cDNA全长序列,再将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni 2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,最后通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的新疆野生盘羊ISG15基因cDNA全长为642bp,开放阅读框为474bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33ku,表达的蛋白可用Ni 2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。
- 鲁海富沈文刘恺崔茹鹏杨文姜方配孙延鸣
- 关键词：野生盘羊ISG15克隆表达活性检测
- 新疆野生盘羊干扰素刺激基因15基因序列的生物信息学分析被引量：1
- 2013年
- 以新疆野生盘羊干扰素刺激基因15(ISG15)基因为研究对象,运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、二级结构以及高级结构进行生物信息学分析,并推测与其他物种的生物进化关系。结果显示:盘羊ISG15蛋白是一个疏水性蛋白,定位于细胞内;该蛋白含有5个α螺旋,7个β折叠,10个转角,有1个跨膜区,无信号肽。通过分子进化树研究发现盘羊的ISG15基因在绵羊、山羊、水牛、牛、猫、人、小鼠和野猪等物种中,与绵羊和山羊的亲缘关系最近。
- 鲁海富崔如鹏刘凯沈文孙延鸣
- 关键词：野生盘羊生物信息学
- ISG15蛋白对感染绵羊肺炎支原体的盘羊杂交羊的免疫调节作用被引量：7
- 2013年
- 为研究重组绵羊ISG15蛋白(rISG15)对感染绵羊肺炎支原体后的盘羊杂交羊的免疫调节效果,本研究将18只盘羊杂交羊随机分为A、B、C 3个组,6只巴什拜羊为D组,全部人工感染绵羊肺炎支原体(CCU=106),感染5 d后A和D组肌肉每天注射生理盐水作为对照组;B和C组每天分别肌肉注射盘羊杂交羊和巴什拜羊的rISG15 200μg/只,并采用荧光定量PCR方法检测试验羊不同时间血液中ISG15、IL-12、IFN-γ的表达水平。结果显示,IFN-γ表达水平在感染第14 d,B组显著高于A、D组(p<0.05),第21 d,B、C组显著高于A、D组(p<0.05);ISG15的表达量在第14 d与21 d,B、C、D组的表达水平显著高于A组(p<0.05);而在此期间,A组的IL-12表达水平显著高于其它各组(p<0.05),但仅A组出现50%的死亡率。实验数据表明rISG15对易感的盘羊杂交羊具有一定的免疫调节效果,为绵羊支原体肺炎防治提供了实验依据。
- 姜方配沈文鲁海富杨文孙延鸣
- 关键词：ISG15肺炎支原体
- 巴什拜羊ISG15基因的克隆与序列分析被引量：1
- 2012年
- 本研究旨在了解新疆巴氏拜羊类泛素蛋白ISG15基因的序列特征。采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到淋巴细胞并提取RNA,设计特异性引物进行RT-PCR,克隆出巴什拜羊ISG15基因序列,回收PCR产物与pMD18-T载体连接后转化DH5α,检测阳性克隆、测序并进行序列分析。结果表明,克隆的巴什拜羊ISG15基因编码区全长为522bp,编码172个氨基酸。BLAST结果表明,巴什拜羊ISG15基因与绵羊、山羊、小尾寒羊、水牛、牛和野猪的ISG15基因序列同源性分别为99%、98%、95%、94%、94%和82%。构建基因进化树分析结果显示,巴什拜羊与绵羊先聚为一类,再与小尾寒羊聚为一类,然后和牛聚为一类。该聚类结果与生物学上的分类一致。
- 崔茹鹏沈文鲁海富孙延鸣
- 关键词：巴什拜羊克隆
- 盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响被引量：1
- 2014年
- 为研究盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响,首先分离试验羊的淋巴细胞,分别将盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白和绵羊肺炎支原体加入体外培养的淋巴细胞中共同孵育,利用real-time PCR技术检测肺炎支原体16SrRNA的表达水平。结果表明,体外淋巴细胞与绵羊肺炎支原体、重组ISG15蛋白共培养12h到96h,盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05),而杂交羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平与对照组差异不显著(P>0.05)。说明盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白在体外可对绵羊肺炎支原体起到抑制作用。
- 沈文鲁海富姜方配杨文崔如鹏孙延鸣
- 关键词：盘羊巴什拜羊绵羊肺炎支原体
- 新疆巴什拜羊ISG15基因的克隆表达及活性检测被引量：1
- 2013年
- 克隆表达新疆巴什拜羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。利用RT-PCR和RACE技术克隆了巴什拜羊ISG15基因的cDNA全长序列,将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的巴什拜羊ISG15基因cDNA全长为646 bp,开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33 ku,表达的蛋白可用Ni2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。
- 鲁海富沈文崔茹鹏杨文姜方配孙延鸣
- 关键词：巴什拜羊ISG15克隆表达活性检测
- 人工感染绵羊肺炎支原体后绵羊血清中细胞因子的动态变化被引量：4
- 2014年
- 为探讨人工感染绵羊肺炎支原体后绵羊相关细胞因子的变化,将18只试验羊分为A、B、C三组,A组为盘羊杂交羊,B、C组为巴什拜羊,其中A、B组气管内感染绵羊肺炎支原体2 mL/只（106CCU/mL）,C组为对照,气管内注射生理盐水2 mL只。应用ELISA方法检测绵羊血清中IL-2、IL-4和IL-6的浓度。结果表明,IL-2的浓度在感染后第1天,A、B两组显著高于C组（P〈0.05）;在第7~14天,B组显著高于A组和C组（P〈0.05）;在第14天,A组显著高于C组（P〈0.05）;在第21天,B组极显著高于A组和C组（P〈0.01）。IL-4的浓度分别在感染后第1、7与14天,A组极显著高于B组和C组（P〈0.01）,其中C组显著高于B组（P〈0.05）。IL-6的浓度在感染后第1天,A组和B组显著高于C组（P〈0.05）;在感染后第7天,A组显著高于B组和C组（P〈0.05）,其中B组显著高于C组（P〈0.05）;第14~21天,A组极显著高于B组和C组（P〈0.01）。说明不同品种的羊对肺炎支原体感染引起的细胞因子的变化有差异,这对研究支原体肺炎发病机理及提供免疫治疗有指导意义。
- 沈文姜方配鲁海富杨文孙延鸣
- 关键词：巴什拜羊IL-2IL-4
