山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2010SW028)
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- 重组人凝血酶真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达
- 2013年
- 目的构建含重组人凝血酶基因的重组真核表达载体,并转染哺乳动物细胞CHO,建立稳定表达重组人凝血酶的细胞株。方法利用限制性内切酶EcoR I和Xba I将凝血酶基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建含人凝血酶基因的重组质粒pcDNA3.1(+)/thrombin,利用双酶切和测序法鉴定。采用阳离子脂质体介导方法,将构建的表达载体转染到CHO细胞中,通过G418加压筛选出阳性细胞克隆,建立稳定表达人凝血酶的细胞株,并扩大培养。采用RT-PCR和SDS-PAGE法检测其mRNA和蛋白质的表达,并对其生物活性进行鉴定。结果重组质粒pcDNA3.1(+)/thrombin经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误;经RT-PCR和SDS-PAGE法鉴定,转染的CHO细胞可表达、分泌人凝血酶,得到的重组人凝血酶表观相对分子质量(Mr)为43 000左右,与预测一致,且具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活为234.1 U/mg。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/thrombin,并成功地在CHO细胞中表达了具有生物活性的重组人凝血酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人凝血酶奠定了基础。
- 刘霞刘飞刘少英朱希强凌沛学
- 关键词：CHO细胞真核表达载体转染
- 人透明质酸酶真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立
- 2013年
- 目的构建人透明质酸酶真核表达载体,并将其转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。方法根据已知的天然人透明质酸酶PH20的氨基酸序列,利用PCR技术,将其克隆至真核表达载体MO2中,得到表达质粒MO2/ph20。经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418(800μg/mL)筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,SDS-PAGE法检测重组人透明质酸酶的蛋白表达水平,利用3,5-二硝基水杨酸法检测筛选得到的4个阳性细胞克隆的生物活性。结果成功构建了MO2/ph20真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因。重组人透明质酸酶表观相对分子质量约为70×103,4个阳性细胞克隆的酶活性均高于9000 U/L,其中MO2/ph20-4细胞株酶活性高达10 000 U/L以上。结论本研究成功构建了能够正确表达人透明质酸酶基因的真核表达载体MO2/ph20,并获得了有生物活性的重组人透明质酸酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人透明质酸酶奠定了基础。
- 刘霞刘飞刘少英朱希强凌沛学
- 关键词：真核表达载体基因表达
