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布鲁杆菌BP26重组卡介苗的构建及对小鼠CD4＋和CD8＋T细胞的影响被引量：3: 2012年; 目的构建预防布鲁杆菌病的新型疫苗——布鲁杆菌BP26重组卡介苗（rBCG—BP26），观察rBCG—BP26对免疫小鼠CD4＋．CD8＋T细胞的影响。方法利用常规分子生物学技术构建重组穿梭分泌载体pMV261-Ag85B—BP26，电转入卡介苗（BCG）后经过卡那霉素抗性筛选，对获得的基因重组株进行PCR鉴定。采用Western免疫印迹法检测菌体和液体培养基中BP26蛋白表达情况。选用45只BALB／c小鼠进行安全性实验分析，将其分成3组：目标实验（rBCG—BP26）组、阳性对照（BCG）组、阴性对照（PBS）组，每组15只。分别在小鼠皮内接种100μl rBCG—BP26[含106克隆形成单位（CFU）]、BCG、PBS。观察各组小鼠体征，在小鼠免疫后的第10、20、30、40天称量体质量，并于尾部采血，用流式细胞仪分析CD4＋,CD8＋T细胞含量。结果成功构建rBCG—BP26重组疫苗株。在菌体和液体培养基中均能检测到BP26蛋白的表达。安全性实验分析表明，3组小鼠在免疫后第10、20、30、40天体质量比较，差异无统计学意义[rBCG—BP26组分别为（19．16±0．55）、（20．89±O．20）、（22．15±0．76）、（24．60±0．64）g；BCG组分别为（19．90±0．02）、（21．53±1．57）、（21．95±0．55）、（24．70±0．39）g；PBS组分别为（19．24±0．54）、（21．37±0．66）、（22．83±0．62）、（25．06±0．37）g；F值分别为2．468、0．331、1．520、0．739，P均〉0．05]。在免疫后第10、20天时，rBCG—BP26组小鼠全血CD4^＋T细胞含量（13．40％、26．70％）低于BCG组（26．70％、33．07％）和PBS组（33．85％、29.33％），rBCG—BP26组CD4＋／CD8＋T细胞含量比值随时间延长而逐渐增长（0．69％、1．27％、1．57％、1．70％）。结论rBCG-BP26能高效表达布鲁杆菌BP26蛋白，并具有毒力弱、能激活机体CD4＋、CD8＋T细胞的特点，可作为预防布鲁杆菌病的疫苗候选株之一。; 诸婷婷张璘陈创夫王远志柳建新王慧; 关键词：布鲁杆菌疫苗卡介苗

绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白基因序列比较研究被引量：2: 2010年; 目的证实新疆分离绵羊附睾种布鲁氏菌019株与参考菌株的差异性。方法采用PCR扩增绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白的Omp31、Omp25、Omp22、Omp2a、Omp2b基因,并进行序列比较分析。结果绵羊附睾种布鲁氏菌019株的5种外膜蛋白基因序列与绵羊种布鲁氏菌参考株在核苷酸水平和氨基酸水平上均存在差异。结论绵羊附睾种布鲁氏菌019株是独特的新疆地方株。; 王远志陈创夫崔步云曹旭东张辉; 关键词：外膜蛋白基因 PCR

布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株的构建与免疫原性的比较研究: 2013年; 目的构建布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株，对比观察其免疫原性与M5—90亲本株的区别，研制毒力弱、安全性能好并能进行鉴别诊断的布鲁杆菌弱毒候选苗。方法利用常规分子生物学技术构建布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株并进行遗传稳定性检测和常规细菌学性质鉴定；用1．0×10^9CFU／2Inl剂量的M5—90亲本株和M5-90△bp26基因缺失株分别免疫绵羊，所得血清与纯化的BP26蛋白进行Westernblot免疫印迹实验，比较M5—90Abp26基因缺失株与M5—90亲本株在体液免疫中对BP26蛋白识别上的差异；用试管凝集试验（SAT）检测受试绵羊不同时期（0、7、14、21、30、45d）的血清效价；安全性试验用1．0×10^6、6．0×10^6、2．0×10^7CFU／O．2ml的M5-90亲本株和M5-90△bp26基因缺失株分别免疫接种小鼠，观察、记录小鼠接种疫苗后的临床症状和死亡情况，比较二者的毒力。结果遗传稳定性检测M5—90亲本株PCR扩增出长度约1279bp的片段，而2—15代的M5-90△bp26基因缺失株扩增出长度约629bp的片段，后者测序结果表明出现bp26基因650bp的缺失；常规细菌学性质鉴定结果，M5-90△bp26由M5—90亲本株的单因子血清试验M型转变为R型，BK2噬菌体裂解实验由阳性转变为阴性，鉴定为深度变异菌株；Westernblot免疫印迹实验表明M5—90△bp26基因缺失株免疫绵羊所获得的血清与纯化的BP26蛋白不发生反应，而M5—90亲本株可发生反应；STA试验表明M5-90△bp26基因缺失株诱导绵羊产生抗体水平（1：50）明显低于M5—90亲本株（〉1：800）；安全性试验表明M5-90△bp26基因缺失株毒力比M5—90亲本株明显减弱。结论成功构建M5-90△bp26基因缺失株。与M5-90亲本株比较，M5-90△bp26基因缺失株具有毒力弱、能区分自然感染与疫苗免疫的特点，可作为标记疫苗的候选株。; 王慧唐利燕范伟兴王远志陈创夫; 关键词：布鲁杆菌免疫原性安全性

新疆北疆部分地区硬蜱伯氏疏螺旋体基因型研究被引量：3: 2014年; 目的调查和鉴定新疆北疆石河子市、沙湾县、伊宁县和察布查尔县媒介蜱，并确定其携带的莱姆病螺旋体的基因型。方法选择4县市6个牧区为调查点，采集羊源寄生硬蜱，结合形态学与16SrRNA进行蜱种鉴定；采用BSK．H培养基对莱姆病螺旋体分离培养，并用硝酸银染色和巢式PCR法进行病原检测，阳性产物测序结果比对，并与11种GenBank参考序列比对，确定莱姆病螺旋体的基因型。结果6个调查点共采集寄生硬蜱900多只，经形态学与16SrRNA鉴定分别为网兰扇头蜱、刻点血蜱、亚洲璃眼蜱和边缘革蜱；从中分别选取样本硬蜱共102只，分24管，分离培养后结合巢式PCR和硝酸银染色共获得16管阳性培养物。5S～23SrRNA基因间隔区测序比对分析表明，所有菌株为伯氏疏螺旋体与国际报道的B．burgdoferi Sensu Stricto（B31）基因型具有高度同源性，同源性为98．6％～99．5％；OspC基因型分析与上述结果一致。结论4县市分离获得伯氏疏螺旋体，基因型为B．burgdorferi Sensu Stricto，且存在生物多样性。从图兰扇头蜱中分离到伯氏疏螺旋体为我国首次报道。; 张璘王远志陈创夫李永祥张科杜景云张亚丽车召堂; 关键词：伯氏疏螺旋体基因型硬蜱

新疆石河子-沙湾地区博尔通古牧场硬蜱形态学和16S rDNA序列分析研究被引量：3: 2014年; 为了掌握新疆石河子-沙湾地区博尔通古牧场畜牧体表寄生硬蜱的分布情况及物种多样性,对该地区12个调查点的寄生蜱类进行考察,采用形态学分类及16S rDNA序列进行遗传进化分析的方法对采集的323只羊和228只牛寄生硬蜱进行研究,从中选取26只硬蜱进行线粒体16S rDNA序列扩增、测序,并与34种GenBank参考序列进行遗传进化分析。结果显示：该地区共鉴定出2科3属7个种的硬蜱。其中2种硬蜱与边缘革蜱（Z97879）16S rDNA序列同源性分别为98.2%和96.8%,遗传距离为0.021和0.026;1种硬蜱与森林革蜱（JF979379）、草原革蜱（JF979375）16S rDNA序列的同源性为95%和96.3%,遗传距离为0.039和0.042;3种硬蜱基因序列与亚洲璃眼蜱（JF979380）16S rDNA的同源性为98.3%～99.8%,遗传距离为0.003～0.017;且获得的1种硬蜱,与刻点血蜱（Z97880）同源性完全相同。结论：首次应用形态学和16S rDNA序列分析报道了新疆石河子-沙湾地区博尔通古牧场牛、羊体表寄生的硬蜱种类,16S rDNA测序分析表明该地区硬蜱与GenBank报道的国际硬蜱有一定差异性,与国内其它省份分离的硬蜱16S rDNA序列亦不完全相同,具有区域差异性。; 张璘李永祥张科杜景云陈创夫王开胜王远志; 关键词：硬蜱形态学鉴定 RDNA 遗传进化

MLVA-16 对新疆分离布鲁氏菌80／23株的鉴定与分析被引量：6: 2013年; 为了对新疆布鲁氏菌分离株80/23株进行分型鉴定,本实验采用MLVA-16检测方法和常规生物学鉴定方法对布鲁氏80/23株进行研究,将测定结果与http://mlva.upsud.fr/MLVA net提供的530株布鲁氏菌数据库比较分析,应用UPGMA进行遗传进化树分析,并构建系统进化树。结果显示,常规分型方法鉴定为羊种3型,MLVA方法鉴定该菌株与德国分离株Bruce0261菌株的亲缘关系最近,属为东地中海3型,羊种1型,两种分型方法种属结果一致。结论:MLVA-16与常规生物学鉴定方法相比,具有更高的精确性,对布鲁氏菌生物型和株间差异有很高的鉴别力。并能为布病疫情流行株的溯源进化关系提供依据。; 任晓莉王慧陈创夫王远志张亚丽Philippe Le Flèche; 关键词：细菌鉴定 MLVA

羊种布鲁杆菌诱导小鼠巨噬细胞的凋亡及caspase3、8、9对细胞凋亡的调控被引量：2: 2013年; 目的观察羊种布鲁杆菌强毒株16M和减毒株M5-90诱导小鼠巨噬细胞RAW264．7凋亡的差异性，以及半胱氨酸蛋白酶（caspase）3、8、9对细胞凋亡的调控作用。方法通过羊种布鲁杆菌16M、M5-90对小鼠巨噬细胞多重感染（细菌数：细胞数=100：1、10：1、50：1）的方式，找出最佳感染复数（MOI）。按最佳MOI=50：1建立布鲁杆菌16M、M5-90感染巨噬细胞的模型，分别在感染后2、4、8、12、24、48h后收集被感染的细胞，计数细胞内细菌菌落形成数量单位，流式细胞仪检测细胞凋亡率及caspase3、8、9对细胞凋亡的影响。结果在感染后2、4、8、12、24、48h，16M在细胞内细菌菌落形成数量分别为10^5.4、10^4.8、10^5.8、10^6.5、10^8.0、10^9.0，M5-90在细胞内细菌菌落形成数量分别为10^6.1、10^6.2、10^6.4、10^6.3、10^6.1、10^5.0，其中在感染后24、48h，强毒株16M较弱毒株M5-90在细胞内寄生菌菌落形成数量明显增加。在感染后2、4、8、12、24、48h，16M诱导的巨噬细胞凋亡率分别为（2．67±0．09）％、（13．13±0．3）％、（6．56±0．42）％、（6．49±0．28）％、（16．07±0．86）％、（24．23±1．67）％，M5-90诱导的巨噬细胞凋亡率分别为（3．62±0．02）％、（32．01±2．59）％、（17．58±0．44）％、（16．09±0．10）％、（62．53±2．70）％、（85．53±0．15）％。对照组巨噬细胞凋亡率分别为[（1.90±0．20）％、（1．92±0．16）％、（1．99±0．03）％、（2．48±0．11）％、（3．56±0．07）％、（5．26±0．33）％]，各组同时间两两比较差距均有统计学意义（P均〈0．01）。其中在感染后24-48h，弱毒株M5-90比强毒株16M更能促进巨噬细胞的凋亡。在感染后24h，对照组caspase3、8,9的表达量分别为（1．47±0．05）％、（1．52±0．02）％、（2．47±0．12）％，M5-90组caspase3、8、9的表达量分别为（9．70±0．46）％、（6．08±0�; 任晓莉王远志陈创夫张亚丽王慧张璘; 关键词：巨噬细胞细胞凋亡半胱氨酸蛋白酶

布鲁氏菌omp25重组BCG的构建及其疫苗作用检测被引量：4: 2013年; 目的构建分泌性表达布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因重组卡介苗(rBCG-omp25),并免疫BALB/c小鼠,观察其免疫作用。方法利用分子生物学技术构建重组穿梭分泌载体pMV261-Ag85B-omp25,电穿孔技术导入卡介苗(BCG)。通过抗生素筛选、重组卡介苗基因组PCR扩增、测序,以及Western blot对重组卡介苗进行鉴定。分别用rBCG-omp25、BCG腹腔接种BALB/c小鼠,于免疫后第10、20、30、40和50d称重,尾部采血,用表达纯化的融合蛋白OMP25-32a检测免疫小鼠抗体的生成情况,用流式细胞仪(FCM)检测CD4+、CD8+T淋巴细胞百分率,并计算CD4+/CD8+T细胞比值。制作小鼠肝组织切片,HE染色观察病理学变化。结果重组卡介苗rBCG-omp25含有Ag85Bomp25序列,大小为745bp;Western blot表明rBCG-omp25可分泌表达布鲁氏菌OMP25。rBCG-omp25免疫小鼠后第20d,用Western blot检测到布鲁氏菌OMP25特异性抗体;rBCG-omp25免疫组和BCG免疫组的CD4+、CD8+T细胞百分率分别为38.68%、11.32%和、48.44%、14.01%,PBS组为33.24%、9.81%,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫后50d内rBCG-omp25组、BCG组与PBS组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05);各实验组小鼠肝组织均未见明显病理改变。结论构建的rBCG-omp25能够表达特异性蛋白OMP25。该蛋白能刺激小鼠产生特异性抗体,能刺激小鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞增殖。rBCG-omp25毒力弱,可作为预防布鲁氏菌病的疫苗候选株之一。; 张亚丽诸婷婷王慧张科陈创夫王梦远王远志; 关键词：布鲁氏菌疫苗卡介苗

新疆边境地区伊宁县图兰扇头蜱形态学及分子生物学鉴定被引量：4: 2015年; 目的对新疆边境地区伊宁县图兰扇头蜱进行形态学和分子生物学鉴定。方法在新疆边境地区的伊宁县随机采集畜牧体表寄生蜱324只,进行形态学初步筛选,从中选取6只形态差异较大的图兰扇头蜱,进行线粒体16S rRNA和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列扩增、测序,并与GenBank登录的图兰扇头蜱参考序列进行遗传进化分析。结果形态学鉴定采集的伊宁县蜱类皆为图兰扇头蜱,两段序列的碱基组成均显示较高的A+T比例(16S rRNA基因为73.8%,COⅠ基因为70.34%),在变异程度上16S rRNA基因较COⅠ基因明显保守。结论首次应用形态学、16S rRNA和COⅠ基因测序分析表明新疆伊宁县采集蜱皆为图兰扇头蜱,并证明图兰扇头蜱具有生物多样性。; 杜景云牟路萌张璘王丽娜王安东张科陈创夫王远志; 关键词：分子鉴定 RRNA基因

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国家自然科学基金(31060334)

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