重庆市医学科研计划项目(2010-2-217)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 相关作者：张赟毕杨李廷玉陈洁龚敏更多>>
- 相关机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金重庆市医学科研计划项目中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 腺病毒介导siRNA抑制全反式维甲酸诱导的骨髓间充质干细胞RARβ表达被引量：2
- 2012年
- 构建携带针对大鼠维甲酸受体β(Retinoic acid receptorβ,RARβ)基因的siRNA重组腺病毒,并感染全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)处理的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),检测其对RARβ的表达及MSCs成神经分化的影响。设计针对大鼠RARβ的4对siRNA的DNA序列,体外退火形成双链,定向克隆至含有U6/H1双启动子的腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,随后与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在BJ5183细菌中同源重组,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad-siRARβ。腺病毒感染大鼠MSCs后经ATRA处理24 h,Real-time、Western blotting及免疫荧光检测RARβ的表达情况。改良神经诱导培养基(Modified neuronal induction medium,MNM)诱导MSCs神经分化,Real-time PCR及免疫荧光检测神经相关蛋白表达。PCR、酶切及测序鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,腺病毒感染大鼠MSCs后可观察到60%以上的细胞有红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达。经ATRA处理24 h,Real-time、Westernblotting及免疫荧光检测发现RARβ表达定位于细胞核,ATRA作用后MSCs中RARβ表达增高16.5±2.34倍(P<0.05),有3组siRNA能有效抑制ATRA诱导的RARβ表达增强,抑制率分别为(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%(P<0.05),且以pool组效果最强,抑制率为(78.09±4.24)%(P<0.01)。ATRA联合MNM诱导MSCs成神经样细胞,表达相关神经特异蛋白Nestin、NSE、MAP-2、Tau,免疫荧光结果显示神经标志蛋白Nestin、NSE、Tju1表达阳性细胞率为(50-88)%,而腺病毒介导的siRARβ能有效抑制MSCs的神经标志物表达水平及阳性细胞率(P<0.05)。成功构建了携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,能有效感染MSCs并显著抑制ATRA诱导的RARβ表达增强和MSCs的神经分化。
- 毕杨龚敏何昀张赟陈洁李廷玉
- 关键词：腺病毒载体骨髓间充质干细胞
- 视黄酸核受体α的siRNA重组腺病毒构建及干扰效果初步鉴定
- 2012年
- 目的：构建视黄酸核受体a（RARa）的siRNA重组腺病毒，为反向研究RARa受体在全反式视黄酸（ATRA）抗凋亡过程中的作用提供实用的技术手段。方法：设计3对大鼠RA风的siRNA序列，将其分别克隆到pSES-HUS穿梭质粒；进而将重组穿梭质粒pSES-HUS-siRARa与pAdEasml在BJ5183感受态大肠埃希菌内同源重组以得到pAd-siRARa，PacI酶切线性化后转染HEK293进行包装扩增以得到重组腺病毒Ad-siRAR^Ad-siRARa感染大鼠PCI2细胞48h，提取各组mRNA和总蛋白，Real-timePCR和免疫印迹检测Ad-siRAR^-I、一2、一3对RARQ的抑制效率。结果：PCR、酶切及测序均证实RARa的siRNA序列正确克隆至腺病毒质粒载体，经过包装扩增得到大量高滴度重组腺病毒Ad-siRARa，而且对RARa的表达抑制效率接近70％。结论：成功构建视黄酸核受体RARⅡ的siRNA重组腺病毒，并具有下调PCI2细胞RARa基因和蛋白表达的功能。
- 龚敏毕杨张赟江伟陈洁李廷玉
- 关键词：小干扰RNA重组腺病毒RNA干扰PC12细胞
