国家自然科学基金(30760182)
- 作品数：10 被引量：21H指数：3
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- 相关机构：贵州大学贵州省动物疫病研究室湘西自治州种畜场更多>>
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- 鸭肠炎病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立
- 2008年
- 设计一对特异性引物扩增出鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因,并将其定向插入到原核表达载体pET32a上,构建了NP基因的原核表达载体pET-NP;将重组载体pET-NP转化表达宿主菌BL21后,经SDS-PAGE分离后行Western blot显示,获得的表达产物具有良好的免疫原性;应用His.Bind亲和层析柱纯化重组NP蛋白,并以此作为包被抗原,初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的iNP-ELISA;经方阵滴定确定,重组蛋白抗原的最佳包被浓度为5.0μg/L,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判定标准为:待检血清OD405值≥1.2,且待检血清OD405和阴性血清OD405的比值≥2.0;应用iNP-ELISA对450份鸭血清样本进行检测,结果iNP-ELISA与全病毒包被的iDEV-ELISA符合率达90.9%。
- 李敏陈彦希代淑燕刘忠伟周碧君文明
- 关键词：鸭肠炎病毒核衣壳蛋白原核表达间接ELISA
- 应用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测人工感染雏鸭体内DEV NP基因表达水平被引量：2
- 2011年
- 为阐明DEV的感染与致病机理,更深入地研究病原与鸭体的相互关系。将鸭肠炎病毒(DEV)强毒GZ株经腿部肌肉注射感染15日龄雏鸭后,应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对NP(病毒核衣壳蛋白)基因转录物进行定量,以检测NP基因在雏鸭体内各组织的表达水平。结果显示:NP基因在所检组织中均有表达,感染后3 h即可在肝、脾、脑、胸腺、肾和肺6种组织中检测到NP基因的表达;感染后6 h,除上述组织外还可在十二指肠和盲肠检测出;感染后10 h又可在胸肌和心肌等检测出。不同受检组织检出量有所不同,且在感染后30或48 h达到高峰,持续至96 h,之后均有所下降。
- 杨颖夏梦殷俊磊杜海燕周碧君文明
- 关键词：鸭肠炎病毒NP基因雏鸭
- 鸭肠炎病毒感染鸭肝酵母双杂交cDNA文库的构建被引量：2
- 2011年
- 为构建应用于酵母双杂交系统的鸭肠炎病毒(DEV)感染鸭肝cDNA文库,利用Trizol法提取接种DEV GZ株病毒液5 d的鸭肝总RNA,利用cDNA合成试剂盒反转录合成双链cDNA,与pGADT7酵母表达载体连接,转化酵母受体菌Y187,以未经稀释、1∶10和1∶100比例稀释的菌液无菌接种于SD/-Leu缺陷型固体培养基,置于30℃培养3 d,随机挑取生长良好的酵母菌落进行菌落PCR,检测插入片段的大小。结果显示,获得的原始文库克隆总数为1.0×106CFU,随机选取23个克隆进行PCR检测,插入片段长度集中在0.5～1 kb之间。结果表明,构建的cDNA文库有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。
- 张荷毛君婷杨颖王开功周碧君文明
- 关键词：酵母双杂交鸭肠炎病毒CDNA文库
- DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测
- 2011年
- 为构建鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因酵母双杂交诱饵载体,采用PCR技术扩增出DEV-NP基因,克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,以PCR检测、限制性酶切和序列测定等方法进行鉴定;然后采用PEG/LiAc法将阳性质粒pGBKT7-NP转化酵母Y2HGold,在不同营养缺失型培养基进行自激活检测,结果显示,经PCR检测和EcoR I/BamHⅠ双酶切,可见到与预期相一致的目的片段;测序表明该片段含DEV NP基因全部序列;转化Y2HGold酵母菌后,在SD/-Trp/X-α-Gal固体培养基上长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体培养基上未见有菌落生长。无自激活作用的诱饵载体pGBKT7-NP的成功构建,为DEV NP宿主结合蛋白的筛选奠定了基础。
- 张荷代淑燕毛君婷王开功周碧君文明
- 关键词：诱饵载体酵母双杂交自激活作用
- 鸭肠炎病毒核衣壳蛋白密码子偏爱性分析被引量：3
- 2011年
- 为给鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因选择良好的宿主表达系统提供参考依据,本研究运用EM-BOSS软件包CHIPS和CUSP程序对DEVNP基因进行了密码子偏爱性分析。结果显示,DEV NP基因的ENC值为51.180,编码NP蛋白的A、I等氨基酸不同密码子的使用频率存在一定的差异;从与DEV NP基因密码子使用频率比值上看,大肠杆菌22个、酵母18个、鸭12个和人20个密码子存在较大的偏爱性。由此可见,编码DEVNP蛋白密码子出现频率较均一,且酵母等真核生物与其密码子偏爱性较为接近,可作为该基因体外表达宿主的首选。
- 高颖代淑燕张荷程振涛周碧君文明
- 关键词：鸭肠炎病毒核衣壳蛋白密码子偏爱性
- 鸭肠炎病毒人工感染雏鸭的病理学动态变化被引量：2
- 2011年
- 为了解鸭肠炎病毒(DEV)人工感染雏鸭引发的临床症状及解剖病变,以DEV GZ株人工感染90只15日龄健康雏鸭,分别在感染后3、6、10、18、30、48、72、96、108 h剖杀,通过观察其临床症状和解剖病变初步研究其致病机理。结果显示,感染的雏鸭48 h后开始出现临床症状,72 h出现死亡,均在108 h内死亡,且随感染时间表现出精神沉郁、呼吸急促、排白色或绿色稀粪、眼部、鼻腔及口腔周围有分泌物附着等临床症状;剖杀雏鸭后发现各组织器官均18 h后出现病变,且随着感染时间延长病变越发严重,主要以出血和坏死为特征。说明已成功复制了DVE动物感染模型,明确了DEV致雏鸭临床症状及各器官解剖病变特点,为该病的诊断初步奠定了理论基础。
- 江楠杨颖李基棕刘忠伟文明
- 关键词：鸭肠炎病毒临床症状解剖病变雏鸭
- 高质量鸭肝脏组织总RNA的提取及稳定性测试被引量：3
- 2009年
- 为获得高质量的鸭肝组织RNA样本,通过优化提取方案,从1 g超低温(-80℃)的冻存组织中提取RNA,以紫外分光光度计对RNA的含量进行了测定,并对其纯度进行了分析;通过琼脂糖凝胶电泳对RNA的完整性进行了检测,并对所得样本的稳定性进行了测试。结果表明:试验得到了1 528μg RNA,样品OD260/OD280=1.93,电泳得到的28 s和18 s RNA条带清晰可见,没有发生降解,样品在室温条件可保存24 h以上,在-20℃可保存8 d以上。提取的RNA质量较高。
- 毛君婷史开志文明周碧君
- 关键词：稳定性
- DEV核衣壳蛋白二级结构与B细胞表位预测被引量：4
- 2008年
- 为预测和分析鸭肠炎病毒NP蛋白的二级结构和B细胞表位，以DEV-NP基因推导的氨基酸序列为基础。采用Chou-Fasman法、Ganmier-Robson法和Karplus-Schulz法预测该蛋白二级结构；按Kyte—Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测其B细胞抗原表位。结果表明，DEV-NP蛋白的二级结构较为复杂，含有较多的转角、无规则卷曲等柔性区域以及α-螺旋与β-折叠区段，且在蛋白肽链中有多个区段可形成B细胞抗原表位，其中第10—15和182—186区段及其附近可能是DEV-NP蛋白的B细胞表位优势区。
- 代淑燕程振涛汪德生文明周碧君
- 关键词：鸭肠炎病毒核衣壳蛋白B细胞抗原表位
- 人工感染雏鸭体内DEV强毒的荧光定量PCR检测被引量：1
- 2010年
- 将鸭肠炎病毒(DEV)强毒GZ株经腿部肌肉注射感染15日龄雏鸭后,应用建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法检测病毒在雏鸭体内各组织的动态分布。结果显示,感染后3 h即可在肝、脾、脑、胸腺、肾和肺6种组织中检出病毒核酸;感染后6 h,除上述组织外还可在十二指肠和盲肠检测到;感染后10 h又可在胸肌和心肌等检测到。不同受检组织病毒核酸检出量有所不同,由高到低依次为脑、肝、脾、胸腺、肾、十二指肠、盲肠、肺、胸肌和心肌。为阐明DEV的致病机理提供了重要的试验数据。
- 杨颖夏梦殷俊磊毛君婷杜海燕周碧君文明
- 关键词：鸭肠炎病毒实时荧光定量PCR雏鸭
- 鸭肠炎病毒核衣壳蛋白受体的筛选与鉴定被引量：11
- 2012年
- 为进一步阐明鸭肠炎病毒(DEV)致病机理,本研究通过构建DEV感染鸭肝组织cDNA文库及其文库质粒和DEV核衣壳蛋白(NP)基因"诱饵"质粒,利用酵母双杂交系统筛选DEV NP互作蛋白(受体)基因,并采用GSTpull-down试验进行验证,结果显示:所构建鸭肝组织cDNA文库的库容量为1×106 CFU,插入片段大小集中在0.5～1kb;"诱饵"质粒pGBKT7-NP无自激活现象;筛选并初步证实DEV NP在鸭肝组织细胞的受体蛋白为蛋白激酶C抑制蛋白(PKCI)。这些结果为进一步研究DEV致病机理提供新的线索。
- 张荷毛君婷杨颖王开功周碧君文明
- 关键词：鸭肠炎病毒核衣壳蛋白酵母双杂交系统
