中国博士后科学基金(20070410831)
- 作品数：9 被引量：11H指数：2
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- 单纯疱疹病毒2型潜伏感染激活模型的建立及潜伏相关转录子开放读码框架抑制后对潜伏相关转录子基因表达的影响
- 2011年
- 目的 研究单纯疱疹病毒2型（HSV-2）潜伏感染激活中潜伏相关转录子（LAT）开放读码框架（ORF）抑制后对LAT基因表达的影响。方法 建立HSV-2潜伏感染复发的神经细胞（SHSY5Y）模型。运用相差显微镜观察HSV-2潜伏及激活后SH-SY5Y细胞形态的变化。对病毒在细胞中的潜伏及激发进行PCR验证并测序。设计3对siRNA，激活诱导后转染SH-SYSY细胞，相差显微镜观察细胞形态变化，RT-PCR半定量检测转染前后LAT ORF表达的改变。结果在存在60 μmol/L阿昔洛韦（ACV）的环境，HSV-2在SH-SY5Y细胞中建立潜伏状态。病毒在SH-SY5Y细胞中最长可潜伏14d。43℃ 1.5 h诱导病毒潜伏激发，而相差显微镜观察发现，病毒激发后细胞病变从24h到72 h，细胞变性、坏死的程度、数量随感染时间延长而增加。HSV-2 LAT、糖蛋白G（gG）基因PCR扩增及电泳结果证实病毒在细胞中的潜伏及激活。LAT ORF-siRNA转染细胞后，LAT ORF mRNA的表达水平在转染后24、36和48 h分别减少了39％、51％和60％。结论 抑制LAT ORF后能够抑制HSV-2 LAT基因的表达，为进一步研究LAT ORF在病毒潜伏感染复发中的作用提供了依据。
- 孙朝晖徐少珊危敏杨慧兰
- 关键词：开放读码框架疱疹病毒2型RNA干扰SH-SY5Y细胞
- 病毒性肝炎联合诊断寡核苷酸芯片的临床应用性研究
- 2007年
- 目的:制备联合诊断乙型(HBV)、丙型(HCV)、丁型(HDV)肝炎病毒寡核苷酸(Oligo)芯片,并进行系列优化及临床应用性研究。方法:首先利用软件Array designer 3.0对BLAST检索所得的HBV、HCV、HDV种属保守序列逐一分析,设计出60mer Oligo探针。用PixSys5500型基因芯片打印仪将设计好的探针打印到氨基化玻片上制备成基因芯片,并对杂交条件进行系列优化以适应临床血清标本的检测。结果:芯片杂交条件进行优化后,芯片检测的敏感性、特异性都大大增强,还缩短了检测时间;杂交结果显示,Oligo芯片检测HBV、HCV、HDV的敏感性、特异性分别为92.2%,85.7%,91.3%和96.0%,94.5%,98.0%。结论:制备的长链Oligo集合肝炎病毒检测芯片检测敏感性、特异性均佳,为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备,同时也为集合更多种、不同亚型肝炎病毒联合检测芯片的制备打下了坚实的基础。
- 孙朝晖危敏王蜀燕王从容石玉玲李林海
- 关键词：寡核苷酸基因芯片
- 同时进行HBV、HCV检测60-mer长链寡核苷酸芯片的研制
- 2007年
- 孙朝晖马文丽危敏王从容王蜀燕石玉玲
- 关键词：寡核苷酸芯片HCV检测CDNA芯片长链
- 血浆循环DNA检测在鼻咽癌诊断研究中的应用被引量：2
- 2009年
- 目的建立并完善一种新的体外循环DNA(cDNA)检测方法,并探讨cDNA检测在鼻咽癌(nasopharyr-geal carcinoma,NPC)患者诊断中的应用价值。方法对196例经病理证实的NPC患者以微量基因组抽提试剂盒抽提血浆DNA,以荧光定量Real-time PCR测定含量,并以健康体检者125例作为对照组。结果临床分期各组与治疗前相比,P均<0.05,可见有明显差异;不论治疗前后,NPC患者各组与正常对照组相比,均有明显差异,P均<0.05;cDNA含量与临床分期的关系:根据Ct值的逐渐减少,可见含量水平随着临床分期增加呈增高的趋势,但组间比较并无统计学意义(P>0.05)。结论利用Real-time PCR法测定NPC患者cDNA,对临床NPC的诊断、疗效判断有较大的价值。
- 孙朝晖石玉玲危敏王蜀燕
- 关键词：循环DNA鼻咽部肿瘤
- 肝炎病毒诊断分型寡核苷酸芯片的制备与应用被引量：1
- 2007年
- 目的研制联合诊断HBV、HDV、HCV及HCV分型的寡核苷酸（Oligo）芯片，并进行系列优化及临床应用性研究。方法从GenBank数据库获取HBV全长DNA序列，HDV及HCV4个基因型全长cDNA序列，根据BLAST分析结果获得HBV、HDV种属保守序列及HCV各型特异性序列，以作为设计Oligo探针的备选序列。用Array designer 3．0分别对BLAST检索所得的HBV、HDV种属保守序列和HCV型特异性序列逐一进行分析，设计长度均一的60mer Oligo探针。从HBV、HDV、HCV种属保守序列和HCV型特异性序列中分别挑选出16、8、68条60 mer Oligo探针。Oligo探针合成和纯化后，用芯片打印仪固定在玻片上。为便于研究，先后制备了2种芯片，包括HBV、HDV诊断芯片、HCV分型芯片。采用限制性显示PCR技术进行样品荧光标记后与芯片杂交，并根据杂交结果筛除了有非特异杂交和信噪比低于4．0的探针，选取高特异的探针制备了HBV、HDV、HCV联合诊断分型芯片。结果从杂交效果来看，研制的Oligo芯片特异性较高，可有效用于HBV、HDV、HCV的联合诊断及HCV的分型。为了适应临床诊断的要求，对芯片进行了实验条件摸索和一些优化，均取得较好的效果。结论制备的肝炎病毒诊断分型芯片检测敏感性、特异性均佳，具有较为广阔的应用前景，为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备。
- 孙朝晖杨慧兰危敏王蜀燕王从容石玉玲马文丽
- 关键词：肝炎病毒寡核苷酸类杂交基因芯片
- 病毒性肝炎联合诊断cDNA芯片的研制与临床应用性研究被引量：1
- 2007年
- 目的制备病毒性肝炎联合诊断cDNA芯片,并进行系列优化及临床应用性研究。方法对于基因组较小的HBV、HDV病毒,采用PrimerPremier5.0软件针对其保守区域设计特异引物,普通PCR技术制备探针;利用限制性显示PCR(RD-PCR)技术制备基因组较大且复杂的HCV芯片探针。为了便于摸索实验条件和更好地进行探针优化,先后制备3种芯片,包括HBV与HDV诊断芯片、HCV诊断芯片及HBV、HDV、HCV联合诊断芯片。结果杂交结果显示HBV与HDV诊断芯片、HCV诊断芯片的诊断效果较为满意。从以上2种芯片中选取探针制备HBV、HDV、HCV联合诊断芯片,并对该芯片的检测质量进行初步评估:①检测线性:病毒质粒拷贝数在104～1011copies/ml之间时,芯片检测法显示了较好的线性(r分别为0.9902、0.9921、0.9819,P<0.01);②特异性:检测黄热病病毒(YFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、登革热病毒(DV)等其他病毒样品结果均为阴性,说明该芯片特异性较好;③重复性:检测HBV、HDV、HCV的批内精密度变异系数(Cv)值为7.1%、7.2%、6.6%,批间精密度Cv值为7.9%、8.2%、7.6%;④准确性:将HBV、HDVPCR片段(共14条)、HCV限制性片段(24条)和部分临床阳性血清(PCR产物)全部进行序列测定,在GenBank中进行Blast比较,结果表明克隆基因均属于相应基因,与理论一致。为了适应临床诊断的要求,对实验条件进行优化,包括减少杂交时间、取消预杂交、将杂交温度提高到52℃等措施。在实验室对芯片进行初步评估后,对临床血清标本进行小规模批量检测实验:用芯片法和实时定量PCR法检测HBV阳性血清(98例)、HCV阳性血清(42例)和阴性血清(130例),对两种方法进行对比,结果显示芯片法检测与实时定量PCR法有良好的相关性(HBV、HCV的r值分别为0.9854和0.9582),检测HBV、HCV、HDV的敏感性和特异性分别为85.7%、76.2%、80.0%和96.7%、95.0%、100%。结论本研究研制的联合诊断芯片敏感性、特异性
- 孙朝晖王蜀燕危敏石玉玲李林海王从容
- 关键词：寡核苷酸序列分析核酸杂交
- HSV-2潜伏感染激活人神经母细胞瘤细胞中siRNA对LAT ORF的抑制作用被引量：1
- 2009年
- 目的探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)潜伏感染复发中LAT基因ORF的siRNA对LAT表达的抑制作用。方法设计3对siRNA,激活诱导后转染SH-SY5Y细胞,相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR半定量检测转染前后LAT ORF表达改变。结果LAT ORF-siRNA转染细胞后,LATORF mRNA的表达水平转染后24,48和72h分别减少了39%,51%和60%。结论LAT ORF-siRNA能够抑制HSV-2 LAT ORF的表达。
- 孙朝晖杨慧兰石玉玲冼江危敏
- 关键词：RNA干扰
- HSV-2333株在Vero细胞中持续感染及增殖特性研究被引量：7
- 2009年
- [目的]探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）在非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中感染及增殖的特性。【方法】将HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代，制备电镜样品观察，于不同时间收获病毒液并测毒力，进行pH值、血清以及在Vero细胞传代、不同感染复数等不同培养条件的摸索。【结果】pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素，最佳收毒时间为36-72h。在Vero细胞上培养病毒3-5代，病毒毒力较高。【结论】建立了HSV-2在Vero细胞上培养增殖的初步方法，为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础。
- 孙朝晖石玉玲冼江王捷杨慧兰
- 关键词：VERO细胞
- 体外针对X基因的小干扰RNA的抗乙型肝炎病毒效应研究
- 2009年
- 目的:探讨体外针对乙型肝炎病毒(HBV)X基因的小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和抗原表达的抵制作用。方法:利用siRNA表达框架法设计针对HBV X基因的siRNA,转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR半定量检测转染前后X基因的表达;ELISA法测定各组24、48、72h HBsAg和HBeAg的含量;荧光定量PCR检测48h时HBV DNA的变化。结果:制备了HBV X基因的siRNA,转染后24、48和72h,HBV X基因mRNA的量分别减少了57%、78%和40%;siRNA能抑制HBsAg和HbeAg的分泌,抑制高峰在48h,抑制率分别为42%和43%;荧光定量PCR证实HBV DNA的复制亦受到抑制。结论:针对HBV X基因的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。
- 孙朝晖石玉玲杨慧兰危敏王蜀燕
- 关键词：乙型肝炎病毒X基因RNA干扰
