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血管生成素样蛋白的研究进展被引量：6: 2007年; 血管生成素样蛋白(ANGPTL)是近年来发现的一类新的分泌性糖蛋白。虽然ANGPTL与血管生成素(Ang)在组成上具有一定的同源性,也具有相似的结构域,但在功能上与Ang又有明显的不同。作为一类新的蛋白族群,ANGPTL的许多方面仍有待于研究。作者就ANGPTL的结构和功能等方面的研究情况作一综述,并对AN-GPTL研究中存在的一些问题提出了一些看法。; 郑敬民朱文杰; 关键词：血管发生

血管生成素样蛋白2真核表达载体的构建及在内皮细胞中的稳定表达研究被引量：9: 2008年; 目的:构建血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)真核表达载体和稳定过表达ANGPTL2的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。方法:以PCR的方法从载体phrGFP-C中扩增人源化绿色荧光蛋白基因hrGFP克隆到载体pIRES的B多克隆位点,构建成载体pIRES-hrGFP;利用合成的寡核苷酸在pIRES-hrGFP的骨架上引入一个便于载体线性化的多种限制性内切酶酶切位点,构建成载体pIRES-hrGFP-MS;以RT-PCR方法从人肾脏总RNA中扩增人ANGPTL2 cDNA,将其克隆到载体pIRES-hrGFP-MS的A多克隆位点,构建成ANGPTL2真核表达载体pIRES-hrGFP-MS-ANGPTL2。将线性化后的pIRES-hrGFP-MS-ANGPTL2以脂质体转染的方法导入HUVEC,利用药物筛选、绿色荧光观察以及ANGPTL2表达分析鉴定稳定过表达ANGPTL细胞株。结果:成功构建便于稳定转染的ANGPTL2真核表达载体pIRES-hrGFP-MS-ANGPTL2;得到了2个过表达ANGPTL2的HUVEC株GFP/ANGP1和GFP/ANGP2。光镜观察发现,ANGPTL2过表达细胞株GFP/ANGP1和GFP/ANGP2的形态由内皮细胞典型的铺路石状变为极度伸展的长梭形,提示ANGPTL2对内皮细胞可能有重要影响。结论:成功地构建了便于稳定转染的ANGPTL2真核表达载体;得到了稳定过表达ANGPTL2的内皮细胞株,为进一步揭示ANGPTL2的功能,探讨其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造了条件。; 郑敬民刘志红黎磊石; 关键词：糖尿病肾病

血管生成素样蛋白2纤维蛋白原样功能域多克隆抗体制备及分析被引量：2: 2005年; 目的:克隆血管生成素样蛋白2(angiopoietin like protein2,ANGPTL2)cDNA;构建ANGPTL2纤维蛋白原样功能域原核表达载体;表达得到ANGPTL2纤维蛋白原样功能域融合蛋白;制备针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体,为全面分析研究ANGPTL2的功能及其与糖尿病肾病微血管病变的关系创造条件。方法:利用RT-PCR方法从肾脏总RNA中扩增ANGPTL2全长cDNA;以其为模板扩增编码ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的cDNA片段,并进而将其克隆至原核表达载体pET-15b上,构建成ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的原核表达载体pET-ANGPTL2;将pET-ANGPTL2导入BL21(DE3)菌内,通过IPTG诱导表达重组蛋白;利用重组蛋白5'端带有Histag的特点,采用含Ni的树脂进行亲和吸附纯化,获取高纯度的重组蛋白;将重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗ANGPTL2多克隆抗体;利用ELISA法测定和免疫组化分析对此多抗的效价和特异性进行分析。结果:取得了带有完整阅读框的ANGPTL2全长cDNA;构建成与预先设计完全一致的原核表达载体pET-ANGPTL2;成功地在大肠杆菌中进行了ANGPTL2纤维蛋白原样功能域融合蛋白的表达,纯化获取纯度很高的重组蛋白;经免疫兔获取高效价的针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体;ELISA检测和免疫组化分析表明,此抗体不仅具有很高的效价,而且具有很好的特异性。结论:我们成功地克隆了ANGPTL2cDNA,构建了其原核表达载体,进行了原核表达,成功取得高纯度的重组蛋白,并得到了高效价、高特异性针对ANGPTL2纤维蛋白原样功能域的多克隆抗体,为全面分析研究ANGPTL2功能及其与糖尿病肾病微血管病变的关系创造条件。; 郑敬民刘志红孙骅贾忠辉陈丹黎磊石; 关键词：多克隆抗体多克隆抗体血管生成素抗体制备功能域全长CDNA 免疫组化分析

血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达研究被引量：8: 2008年; 利用半定量RT-PCR和免疫组化的方法同时从mRNA水平和蛋白质水平对血管生成素样蛋白2在不同病理阶段的2型糖尿病肾病模型小鼠——db/db小鼠肾脏中的表达情况进行了较为系统的分析.结果发现:a.在糖尿病前的db/db小鼠(4周龄的db/db小鼠),血管生成素样蛋白2与作为正常对照的db/m小鼠相比,差异不是很大,随着肥胖的加剧,高血糖、蛋白尿的出现,血管生成素样蛋白2在db/db小鼠肾脏中的表达无论从mRNA水平还是从蛋白质水平均显著升高.b.从免疫组化的分析结果来看,血管生成素样蛋白2主要分布于小鼠肾脏的肾小球部分,主要是沿毛细血管袢呈线性分布,其位置与足细胞的位置重叠,足细胞是小鼠肾脏中血管生成素样蛋白2的主要分泌细胞.c.小鼠肾脏血管生成素样蛋白2的表达水平似乎还与鼠龄相关:虽然变化幅度不是很大,但在周龄较大的小鼠(如20周龄以上),其表达水平相对较高.上述工作不仅印证了先前对2型糖尿病肾病患者肾小球基因表达谱的分析结果,更加明确了血管生成素样蛋白2与糖尿病肾病的相关性,同时揭示了血管生成素样蛋白2在正常小鼠和糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达、分布和变化规律,有利于进一步揭示血管生成素样蛋白2的功能及其在糖尿病肾病发生、发展过程中的可能作用,探讨糖尿病肾病的分子机制.; 郑敬民刘志红黎磊石; 关键词：糖尿病肾病 DB/DB小鼠

血管生成素样蛋白2单克隆抗体的制备和分析被引量：10: 2007年; 目的:研制抗人血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造条件。方法:以纯化的ANGPTL2重组蛋白皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养基筛选,克隆和亚克隆化培养,ELISA鉴定,得到能稳定分泌抗人ANGPTL2的杂交瘤细胞;以硫酸铵沉淀法从杂交瘤细胞培养上清中初步纯化、制备抗人ANGPTL2单抗,以Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色相结合的方法对制备的单抗进行滴度和特异性鉴定。结果:得到1株能稳定分泌抗ANGPTL2的杂交瘤细胞,从其培养上清中制备的抗ANGPTL2单克隆抗体具有较好的特异性和较高的滴度,可用于Western blot、细胞免疫染色和免疫组化染色。结论:成功地研制了抗ANGPTL2单克隆抗体,为进一步进行ANGPTL2的表达分析和功能研究,揭示ANGPTL2的功能及其在糖尿病肾病发生发展过程中的可能作用创造了条件。; 郑敬民刘志红仇镇宁黎磊石; 关键词：单克隆抗体

血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病中的表达及意义被引量：5: 2005年; 目的:观察一种新发现的血管生成相关生长因子血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)在糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)肾小球中的表达特征,并对其在DN发生发展过程中可能的作用机制进行初步探讨。方法:采用肾活检组织肾小球微分离技术结合半定量RTPCR方法,观察24例2型DN患者肾小球中ANGPTL2mRNA表达情况,以8例移植供肾活检组织作正常对照。并将其表达水平与DN患者临床病理指标进行相关分析。结果:DN患者肾小球ANGPTL2表达阳性率显著高于对照组(95%vs38%,χ2=15.9,P<0.01)。在表达明显上调(>2倍)的患者中,肾小球微血管瘤、内皮细胞炎性浸润与泡沫化变性的发生率明显少于其他患者(22%vs66%;11%vs73%;11%vs53%;P<0.05)。结论:ANGPTL2是一种血管生成相关的内皮细胞生长调节因子,参与DN微血管病变的发生机制。该因子在糖尿病肾小球中表达的上调可能是内皮损伤与血管重构过程中的一种应激性反应,具有维持内皮细胞功能与毛细血管正常结构的保护性作用。; 孙骅郑敬民陈姗陈丹曾彩虹刘志红黎磊石; 关键词：糖尿病肾病基因表达

血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病小鼠肾组织中的表达定位被引量：6: 2009年; 目的:血管生成素样蛋白2是近年来发现的与血管发生密切相关的新蛋白,在既往研究中已发现血管生成素样蛋白2在肾中的表达水平与糖尿病肾病的病理过程相关,但未对血管生成素样蛋白2在肾脏中的表达进行精确定位。文中分析血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病小鼠肾小球和肾小管中的表达情况,并对其在糖尿病肾病小鼠肾脏细胞中进行准确定位。方法:利用激光微分离技术分离糖尿病肾病小鼠肾脏组织中的肾小球和肾小管,以半定量RT-PCR方法分析血管生成素样蛋2 mRNA在肾小球和肾小管中的表达情况;利用免疫组化、免疫荧光双套色染色和免疫电镜方法对血管生成素样蛋白2在肾中的表达进行准确定位。结果:半定量RT-PCR分析结果显示血管生成素样蛋白2 mRNA仅表达于肾小球,而不在肾小管表达,且db/db糖尿病肾病小鼠肾小球中的血管生成素样蛋白2 mRNA水平明显高于正常对照;免疫组化分析结果显示血管生成素样蛋白2分布位置与足细胞位置重叠;免疫荧光双套色染色观察到,血管生成素样蛋白2分布与足细胞特异性标记蛋白WT1一致;免疫电镜分析结果显示,血管生成素样蛋白2主要分布于足细胞的细胞体和足突。结论:在糖尿病肾病小鼠肾,血管生成素样蛋白2基因只在肾小球表达,足细胞是血管生成素样蛋白2的特异性产生细胞。; 郑敬民刘志红张明超朱小东黎磊石; 关键词：糖尿病肾病足细胞

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江苏省自然科学基金(BK2005086)

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