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5型腺病毒载体对人T淋巴细胞的转染及细胞毒性分析被引量：2: 2014年; 目的:利用5型腺病毒载体转染人T淋巴细胞,对其转染T淋巴细胞的效率以及细胞毒性进行分析。方法:选取T淋巴瘤Jurkat细胞及原代T细胞,腺病毒按感染复数(multiplicity of infection,MOI)为20、50、100、200和400对其转染,转染48 h后利用流式细胞术检测转染效率;选取腺病毒转染后的不同时点,利用碘化丙啶染色法分析转染对于细胞周期的影响;利用Annexin V/7-AAD染色法分析转染诱导细胞凋亡情况;利用台盼蓝染色计数法分析转染对活细胞数目的影响。结果:5型腺病毒载体转染T淋巴瘤的效率最高,转染效率随着MOI值的增大而增加;CD8+T细胞和CD4+T细胞的转染效率大致相同,T细胞经刺激活化后,CD8+T细胞的转染效率下降;病毒转染未导致明显细胞凋亡;病毒转染对细胞周期与活细胞数目没有显著影响。结论:5型腺病毒载体转染T细胞呈现较低细胞毒性。; 张文峰张琼宇邵红伟吴凤麟王腾黄树林; 关键词：腺病毒载体 T淋巴细胞细胞毒性

腺病毒感染及胞内运输途径的研究进展被引量：1: 2014年; 目前关于腺病毒感染及胞内运输的分子机制研究主要来源于C亚群腺病毒在肿瘤细胞系中的研究结果。腺病毒对靶细胞的感染及胞内运输大致分为几步:病毒与细胞表面受体的特异结合,胞吞介导的病毒内化,病毒逃脱胞内体进入细胞质,病毒沿着微管运输至核孔,病毒基因组入核。病毒胞内运输效率极高,感染后1 h,80%以上的病毒基因组被送至核内。但是腺病毒胞内的运输方式会因以下几个因素变化而产生差异:靶细胞类型,细胞生理状态,病毒血清型。文中对腺病毒感染靶细胞及胞内运输的已有分子机制进行综述,为临床基因治疗用途的病毒载体研发提供思路。; 张文峰邵红伟贺华黄树林; 关键词：腺病毒胞吞病毒受体

5型和35型腺病毒纤毛蛋白的原核表达及活性验证: 2013年; 目的:原核表达5型腺病毒纤毛蛋白(Ad5 fiber)和35型腺病毒纤毛蛋白(Ad35 fiber),并对蛋白活性进行初步分析。方法:将重组质粒pET28a-Ad5 fiber和pET28a-Ad35 fiber转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经Ni-NTA凝胶珠亲和纯化,用SDS-PAGE鉴定纯化蛋白,并用蛋白竞争性实验验证纯化蛋白的活性。结果:转化溶原菌后能够表达目的蛋白,Ad35 fiber蛋白对Ad5(5型腺病毒)感染无影响,只能阻断Ad5F35(5型腺病毒纤毛被替换为35型腺病毒纤毛的嵌合腺病毒)对细胞的感染;Ad5 fiber蛋白对嵌合腺病毒Ad5F35感染无影响,只能抑制Ad5对细胞的感染。结论:成功表达具有生物活性的5型和35型腺病毒纤毛蛋白,为进一步研究嵌合腺病毒Ad5F35感染细胞的机制奠定基础。; 张文峰张琼宇薄华本邵红伟李晓程王腾黄树林; 关键词：原核表达

肿瘤患者偏移的T细胞TCRBV表达谱在自体CIK细胞中的恢复: 2015年; 目的研究肿瘤患者自体PBMC经体外诱导培养的CIK细胞群TCRBV亚家族表达的变化。方法Ficoll密度梯度离心法分类人体外周血单核细胞（PBMC）,经IFN-γ、OKT-3以及IL-2诱导培养,Trizol试剂提取总RNA,RT-PCR半定量分析24个TCRBV亚家族表达情况,流式分选平台分选CD3＋CD8＋细胞和CD3＋CD56＋细胞亚群。结果诱导培养后的CIK中,分化的CD3＋CD56＋细胞亚群比例占12.6%~41.7%。PBMC中弱表达或缺失的TCRBV亚家族,在CIK中上调或恢复表达。CIK细胞群中,CD3＋CD8＋细胞和CD3＋CD56＋细胞亚群克隆组成无明显差异。结论肿瘤患者自体PBMC体外诱导培养CIK细胞后,部分表达偏移的TCRBV亚家族能恢复表达,表明部分受损或被抑制的T细胞克隆在CIK培养中被激活并增殖。; 彭鑫王腾邵红伟黄树林; 关键词：CIK T细胞 RT-PCR

肿瘤特异性TCRαβ基因转染诱导记忆性T细胞分化及其免疫功能的研究: 2013年; 目的研究特异性TCR基因转染T细胞被肿瘤抗原激活后,记忆性T细胞的分化情况,并明确其表型特征和免疫功能。方法密度梯度离心法分离PBMC,重组TCR腺病毒感染T细胞,流式细胞术检测外源TCR表达效率。AFP表位肽刺激T细胞,流式细胞术检测TCR基因转染T细胞经抗原刺激后,记忆性T细胞标志分子表达。MTT法检测T细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果重组腺病毒载体感染3 d后,外源TCR表达比例接近30%。特异性TCR基因转染可有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化,CD45RO+细胞比例逐渐上升至接近50%。CD45RO+细胞以CD62L–CD44+表型为主。此后CD62L+细胞比例逐渐上升。最终出现分群明显的CD62L+CD44+TCM表型细胞。特异性TCR基因转染能够促进T细胞杀伤AFP+靶细胞,诱导靶细胞凋亡,并促进IFN-γ分泌。抗原预先刺激能够进一步增强TCR基因转染T细胞抗肿瘤免疫效应。结论 TCR基因转染能够有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化。经肿瘤抗原预先刺激的TCR基因转染T细胞将启动记忆性T细胞分化,在再次遭遇表达相同抗原的肿瘤细胞时发挥更为强烈的免疫效应。; 吴凤麟张文峰何免杨暖薄华本邵红伟黄树林; 关键词：转染

HRM法检测肿瘤细胞PTEN基因突变实验研究被引量：1: 2016年; 目的:探索高分辨率熔解曲线(HRM)法检测肿瘤细胞系PTEN基因突变中的应用。方法:采用HRM法初筛肿瘤细胞系PTEN的突变,测序验证HRM筛选结果,TA克隆测序进一步明确突变情况。结果:HRM初筛出Jurkat细胞PTEN基因存在突变,测序结果与HRM结果一致,TA克隆测序确定Jurkat细胞系PTEN基因为缺失突变。结论:HRM法可准确筛选肿瘤细胞系中PTEN基因突变,适于肿瘤细胞PTEN基因突变筛选。; 贺华王腾彭鑫苏畅邵红伟黄树林; 关键词：HRM 突变 PTEN TA克隆

特异性TCRαβ基因转染T细胞促进抗肿瘤免疫的研究被引量：3: 2014年; 目的:研究肝癌特异性TCR基因TCRVα12.2-Vβ7.1转染T细胞后,促进T细胞识别肿瘤抗原,活化抗肿瘤免疫反应的效果。方法:构建重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV,以之感染T细胞并优化最佳感染条件。钙黄绿素染色法检测T细胞对不同肿瘤靶细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。流式细胞术检测T细胞表面FasL表达比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果:成功将TCRVα12.2-Vβ7.1基因片段构建入嵌合型腺病毒载体,获得重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV。感染复数为100时,重组腺病毒有最高转染效率。感染3天后,TCRVα12Vβ7阳性细胞比例超过25%。特异性TCR基因转染有效促进T细胞杀伤AFP阳性肝癌细胞,特异性裂解率显著提高(P<0.001)。特异性TCR基因转染有效促进T细胞诱导靶细胞凋亡(P<0.001)。同时,T细胞表面FasL表达比例上升(P<0.001)。TCR基因转染T细胞作用于AFP抗原阳性靶细胞后IFN-γ分泌显著提高(P<0.001)。结论:重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV成功介导肿瘤特异性TCR基因转染T细胞。TCR基因转染可有效促进T细胞识别抗原阳性肿瘤细胞,并发挥抗肿瘤免疫效应。; 吴凤麟张文峰何免杨暖沈晗薄华本邵红伟黄树林; 关键词：TCR 基因转染 T细胞抗肿瘤免疫

一种基于TIL的肿瘤相关抗原特异性T细胞的筛选方法: 2014年; Wolfl 等[1]的研究建立了一种以 CD137为表面标记，从人 CD8＋T 细胞中快速鉴定和分离抗原特异性 T 细胞的方法。由于 CD137分子表达于活化的 CD4^＋和 CD8^＋T 细胞表面[2]，其表达上调依赖于 T 细胞经抗原刺激后活化，并可在抗原刺激后12 h ~5 d 内持续表达[3]。因此可以CD137为标记，从 T 细胞中检测和分离比例较低的抗原特异性 T 细胞。; 吴凤麟韦嘉灝贾筠何免邵红伟黄树林; 关键词：抗原特异性T细胞 TIL CD137 CD8^+T 抗原刺激

Survivin-2B诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究被引量：1: 2014年; 目的:探讨存活蛋白2B(survivin-2B)在诱导肿瘤细胞凋亡中的分子机制。方法:将survivin-2B基因插入真核表达载体pCDNA3.1,得到重组载体pCDNA3.1-survivin-2B。将空载体pCDNA3.1及重组载体pCDNA3.1-survivin-2B分别转染人乳腺癌细胞株MCF7,转染后48 h,用annexin V/7-AAD染色法分析细胞凋亡情况,利用碘化丙啶染色法分析转染对细胞周期的影响;同时提取总RNA并反转录成cDNA,进行多重聚合酶链反应。利用GeXP多基因表达分析系统检测21个与肿瘤相关基因的表达情况。结果:过表达survivin-2B基因导致MCF7细胞凋亡与细胞周期阻滞,并引起8个基因表达上调,2个基因表达下调。变化最大的为醛脱氢酶4家族成员A1(ALDH4A1),表达下降48%;变化最小的为胞质分裂调控蛋白1(PRC1),上调1.08倍。结论:Survivin-2B能够诱导细胞凋亡与细胞周期G2/M期阻滞,并引起部分肿瘤相关基因的表达变化。; 张文峰贾筠吴凤麟沈晗邵红伟黄树林; 关键词：细胞凋亡乳腺肿瘤存活蛋白

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东莞市科技计划项目(2011105102027)

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