天津市自然科学基金(043609211)
- 作品数：13 被引量：31H指数：3
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- 氯化锂对大鼠肝细胞葡萄糖6磷酸酶基因表达的影响被引量：3
- 2006年
- 目的:探讨利用糖原合成酶激酶3的抑制剂氯化锂对葡萄糖6磷酸酶基因表达的影响。方法:将原代培养的大鼠肝细胞在葡萄糖和不同浓度氯化锂的培养液中培养4h后提取RNA,以半定量RT-PCR方法检测细胞葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6PC)和6磷酸葡萄糖转运亚基(G6PT)的mRNA水平。结果:氯化锂(10mM、20mM)与高糖培养液联合培养肝细胞4h后,肝细胞葡萄糖-6-磷酸酶的催化亚基和转运亚基的mRNA的丰度均下降(P<0.05)。结论:锂盐可能能够有效的抑制葡萄糖-6-磷酸酶的表达起到胰岛素增敏的作用。对葡萄糖-6-磷酸酶进行干预能够有效的改善糖尿患者的高血糖状态。
- 刘德敏方显峰孙颖张捷
- 关键词：葡萄糖-6-磷酸酶氯化锂基因表达原代肝细胞
- 大鼠肝细胞的原代培养及鉴定被引量：8
- 2006年
- 目的:探讨大鼠肝细胞原代培养的方法及细胞的鉴定。方法:采用胶原酶消化获取大鼠肝细胞进行纯化、培养,并采用免疫组织化学方法对其进行鉴定。结果:培养的肝细胞产量高、活力好,用相差显微镜对不同生长时期的肝细胞进行观察证实了细胞贴壁后变平变薄,双核细胞和多核细胞呈岛状连接的形态学特性,采用抗大鼠细胞角蛋白(ck18)的特异抗体进行免疫组化细胞爬片鉴定,经SP染色DAB显色后,阳性着色部位在胞浆呈棕黄色颗粒,阴性对照未见着色。结论:成功地体外培养了大鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定了基础。
- 刘德敏赵慧茹杨莉丽孙颖
- 关键词：肝细胞细胞培养技术免疫组织化学
- PPARγ,、TLR4基因多态性与2型糖尿病的相关性研究被引量：8
- 2008年
- 目的:探讨天津地区人群中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因Pro12Ala及toll样受体4(TLR4)基因Asp299Gly、Thr399Ile的多态性与2型糖尿病(T2DM)的关系。方法:提取365例T2DM患者(T2DM组)和95例健康人(对照组)的基因组DNA,PCR扩增目的片段后,用变性高效液相色谱技术(DHPLC)筛查基因突变情况。结果:T2DM组和对照组PPARγ基因Pro12Ala位点P/A的基因型频率分别为0.0740和0.0316(27/365和3/95),差异无统计学意义(P>0.05);两组均未筛查到TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile突变基因型。结论:天津地区人群PPARγ基因Pro12Ala、TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile多态性与T2DM无明显关联。
- 胡文超刘德敏孙颖张捷
- 关键词：PPARΓTOLL样受体4
- 绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建被引量：2
- 2007年
- 目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)标记的人脂联素(Adiponectin)真核表达质粒。方法:用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18-T/Adiponectin为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段,将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO上,转化入TOP10感受态细胞中,通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin。结果:PCR获得长度为736bp的目的片段,经pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列(AccessionNM-004797)100%匹配。结论:绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。
- 刘德敏杜春红孙颖张捷
- 关键词：脂类质粒绿色荧光蛋白质类
- 人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达被引量：2
- 2008年
- 目的:构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行鉴定。方法:将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ADPN,并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。结果:PCR获得长度为753bp目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入的目的片段与GenBank检索的人脂联素cDNA序列(Accession NM-004797)100%匹配;含重组Adiponectin质粒的大肠杆菌经0.4mmol/L的IPTG诱导6h后有表达。结论:应用并成功构建了人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN,且在大肠杆菌中获得有效表达。
- 史晓文刘德敏孙颖张捷
- 关键词：胞间信号肽类和蛋白质类基因表达大肠杆菌脂联素
- 糖尿病新型分子靶点葡萄糖-6-磷酸酶活性的检测及应用被引量：1
- 2007年
- 目的:研究利用葡萄糖脱氢酶偶联反应测定葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)的活性,并推荐其作为一种常用的实验室检测方法。方法:以胶原酶原位灌注消化的方法分离大鼠肝细胞,用含10%FBS的1640培养液进行原代培养。待细胞贴壁后分别换用新鲜的含葡萄糖和不同浓度栎精的培养液培养16 h,随后利用葡萄糖脱氢酶偶联反应测定酶的活性。结果:各组G-6-Pase的活性不全相同,其差别具有统计学意义(F=114.423,P<0.05);高糖组与对照组相比较,G-6-Pase的活性明显增加(P<0.05);不同浓度栎精组G-6-Pase的活性下降,均低于高糖组(P<0.05),但其组间差异无统计学意义(P>0.05),没有呈现出剂量依赖性变化。结论:利用葡萄糖脱氢酶偶联反应测定葡萄糖-6-磷酸酶活性,是目前值得推崇的一个检测速度较快、结果较稳定的方法。此外,栎精能够有效逆转高糖诱导的G-6-Pase活性增加,利用它对于G-6-Pase活性的干预作用可能改善糖尿患者的高血糖状态。
- 孙颖刘德敏
- 关键词：葡萄糖-6-磷酸酶肝细胞糖尿病
- 人脂联素基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达
- 2007年
- 目的利用杆状病毒表达系统探讨人脂联素(ADPN)基因在Sf9昆虫细胞中的高效表达。方法利用PCR方法扩增人脂联素基因,与pFastBac1质粒连接,转化入含有穿梭载体bacmid的大肠杆菌DH10Bac中,筛选发生转座作用的重组穿梭载体Bacmid-ADPN并转染Sf 9昆虫细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf 9细胞形态变化明显,能够表达出与脂联素多克隆抗体相结合的蛋白,蛋白分子质量约为30 ku。结论人脂联素基因在真核细胞中成功得到表达,为进一步研究其生物学活性和作用机制奠定基础。
- 刘徳敏丁玉静孙颖张捷
- 关键词：脂联素杆状病毒昆虫细胞
- 二甲双胍对糖尿病大鼠肝脏葡萄糖-6-磷酸酶表达的影响
- 2007年
- 目的:探讨二甲双胍抑制肝糖输出,减轻肝脏胰岛素抵抗的分子学机制。方法:建立糖尿病大鼠模型并将之分为正常对照组、糖尿病组、低剂量二甲双胍干预组、高剂量二甲双胍干预组,饲养2周后取出肝脏,以半定量RT-PCR方法测定肝脏葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)mRNA的表达,蒽酮比色法测定肝脏糖原含量。结果:(1)糖尿病组肝脏G6Pase催化亚基(P36)及转运亚基(P46)mRNA的灰度高于正常对照组(P<0.05),而肝脏糖原含量低于正常对照组(P<0.05)。(2)二甲双胍可以明显减少肝脏G6Pase mRNA表达并增加肝糖原含量(P<0.05),且呈剂量依赖性。结论:二甲双胍能够抑制糖尿病状态下肝脏G6Pase催化亚基及转运亚基mRNA表达,使得6-磷酸葡萄糖向葡萄糖的转化减少,从而减少肝糖输出,达到减轻胰岛素抵抗的作用。
- 张景云张秋梅于德民刘德敏
- 关键词：二甲双胍糖尿病
- 人脂联素基因在L-02细胞中表达及其功能检测被引量：1
- 2008年
- 目的:在人正常肝细胞株L-02中表达外源人脂联素蛋白,并观察其生物学活性。方法:采用脂质体法将成功构建的人脂联素真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin转染L-02细胞;免疫组织化学定位观察脂联素的表达;Western blot检测培养上清及细胞沉淀中脂联素水平;酶联免疫法测定培养基血糖。结果:构建的真核表达质粒能有效转染L-02细胞,并在培养上清及细胞沉淀中检测到脂联素蛋白,该重组蛋白能够降低高糖处理的L-02细胞的血糖水平。结论:重组人脂联素蛋白能在L-02中有效表达,该蛋白定位在细胞质,并且能分泌到胞外,表达产物经体外实验证实具有生物学活性。
- 杜春红刘德敏
- 关键词：脂联素基因转移技术重组蛋白脂质体
- 栎精对葡萄糖-6-磷酸酶基因表达及活性的影响被引量：3
- 2007年
- 目的:探讨栎精对葡萄糖-6-磷酸酶基因表达及活性的影响。方法:将原代培养的大鼠肝细胞在含有25mmol/L的葡萄糖和不同浓度的栎精培养16h后提取RNA,以半定量RT-PCR方法检测葡萄糖-6-磷酸酶的催化亚基(G6PC)和转运亚基(G6PT)的mRNA水平,并应用葡萄糖双脱氢酶偶联法测定葡萄糖-6-磷酸酶的活性。结果:25mmol/L葡萄糖能够使G6PC和G6PT的mRNA水平升高2倍左右(P<0.05),不同浓度的栎精可抑制G6PC和G6PT的转录及酶的活性。结论:栎精能够抑制体外葡萄糖-6-磷酸酶基因的表达及其活性。
- 孙颖刘德敏赵慧茹张捷
- 关键词：基因表达RNA信使肝细胞WISTAR
