国家自然科学基金(30970073)
- 作品数：4 被引量：14H指数：2
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- 相关机构：中国科学院福建师范大学北京农学院更多>>
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- 相关领域：生物学更多>>
- 里氏木霉RutC30常温常压等离子体ARTP)诱变筛选pyr4基因缺陷型菌株及转化系统的建立被引量：7
- 2014年
- 以里氏木霉Trichoderma reesei重要工业生产菌Rut C30为出发菌株,通过等离子体(ARTP)诱变筛选,以5‐氟乳清酸(5‐FOA)和尿苷(Uridine)进行筛选,获得一株pyr4基因缺陷株Rut C30ΔU3。用含有野生型里氏木霉pyr4基因的互补质粒转化突变株,可回复野生性状。经测序发现其pyr4基因在核酸序列多个位点发生突变,其中包括两个错义突变和一个移码突变,从而导致乳清酸核苷‐5′‐磷酸脱羧酶失活。经遗传稳定性研究分析,传代5次后仍保持良好的尿苷依赖性、去葡萄糖阻遏以及高产纤维素酶特性。经实验筛选获得了pyr4基因缺陷菌株可作为基因表达系统的受体菌株,建立了以尿苷营养缺陷为筛选标记的木霉转化系统。
- 安莉颖易欣欣秦丽娜施思陶勇伍红董志扬
- 关键词：里氏木霉等离子体诱变
- 里氏木霉双基因同步缺失菌株的构建与甘露聚糖酶表达研究被引量：2
- 2014年
- 在里氏木霉中建立了一个快速的双基因位点同步同源重组新方法,较好解决了里氏木霉基因逐个敲除周期长等问题。研究以里氏木霉自身甘露聚糖酶基因(man5A)为重组表达的报告基因,通过一步转化,将该基因定点整合入纤维二糖水解酶Ⅰ(cbh1)基因位点,同时缺失主要的两个纤维素酶基因(cbh1、cbh2),得到重组工程菌Man12。将重组工程菌Man12与出发菌株Tu6Δku70进行摇瓶发酵,结果显示,重组菌株的甘露聚糖酶产量比出发菌株提高10倍,而纤维素酶产量降低了60%,胞外总蛋白分泌水平降低了40%。Real‐time PCR检测甘露聚糖酶基因(man5A)的转录水平,发现重组菌株较出发菌株提高了25倍。在里氏木霉中首次报道了通过一步转化实现两个基因同步定点整合的方法,对利用基因工程手段构建高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌株具有一定的指导意义。
- 吴鸿清秦丽娜陈秀珍黄建忠董志扬
- 关键词：里氏木霉纤维素酶基因
- 糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)漆酶POXA1在里氏木霉中的高效表达及酶学性质被引量：7
- 2012年
- 【目的】将优化后的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)漆酶基因pox1,在里氏木霉中进行高效表达并对重组表达的漆酶进行酶学性质测定。【方法】:根据里氏木霉的密码子偏好性,对漆酶POXA1密码子进行优化并合成。以质粒pBluscriptⅡSK(+)为骨架,利用里氏木霉纤维二糖水解酶基因(cbh1)的启动子和终止子序列构建里氏木霉外源蛋白表达载体pSKLDT。PEG介导的原生质体转化方法转化里氏木霉菌株Tu6,筛选获得漆酶表达工程菌;通过木霉工程菌摇瓶发酵培养后对发酵液上清中的漆酶进行纯化,并对异源表达的漆酶酶学性质进行研究。【结果】经尿嘧啶缺陷培养基筛选获得木霉阳性转化子,通过PCR分析及漆酶酶活性筛选获得漆酶高效表达重组菌LC-7,该重组菌经摇瓶发酵144h后粗酶液酶活达237.134IU/mL,酶活较其出发菌Pleurotus ostreatus提高了28.6倍。酶学性质研究表明,纯酶的比活为9852IU/mg,最适温度为50℃,最适pH为3.0,最适底物为ABTS,该漆酶催化ABTS的Km和Vmax分别为7.58×10-2mmol/L及9.752×10-3mmol/L/min,金属离子Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+、Mg2+等对漆酶有不同程度的抑制作用,但Fe2+能明显的抑制漆酶的催化活性。【结论】外源漆酶基因能在里氏木霉中实现高效分泌表达。
- 董欣睿秦丽娜陶勇黄建忠董志扬
- 关键词：漆酶里氏木霉异源表达糙皮侧耳
- 里氏木霉不同糖苷水解酶基因转录水平比较分析被引量：1
- 2012年
- 以前期里氏木霉RNA-seq中发现的7个糖苷水解酶基因为对象,分析其不同条件下的表达特性,以期为寻找新的纤维素降解功能酶提供证据。运用生物信息学方法,分析了7个基因可能的编码产物和结构特征。以不同的产纤维素酶菌株(QM9414、RUTC30)为材料,采用实时荧光定量PCR,对7个糖苷水解酶基因(编号4-10)在各种碳源条件下转录情况与主要的3个纤维素酶基因cbh1,cbh2,egl1(编号1-3)进行了比较分析。信息学分析表明,7个基因编码蛋白分属于GH47(4号、5号),GH92(6-8号),GH16(9号),GH31(10号)糖苷水解酶家族,具有典型的信号肽序列。cbh1,cbh2,egl1基因在纤维素酶诱导条件下,转录水平均表现显著的增加,上调倍数以QM9414菌株表现的最高。QM9414菌株中,cbh1,cbh2,egl1基因在纤维素条件下的上调倍数显著高于乳糖,3个基因在RUTC30菌株中的转录水平则显示乳糖条件下上调幅度更大。7个糖苷水解酶基因也存在类似的情况,而且编码α-甘露糖苷酶和内切β-葡聚糖酶的8号、9号基因上调倍数在纤维素酶诱导条件下仅次于纤维素酶基因,而以甘油为碳源条件下,8号、9号基因上调倍数高于纤维素酶基因。4号基因在上述碳源条件下,转录水平变化不大。结果表明:4号基因可能是组成型表达。基因5、6、7、8、9、10的表达呈现明显的菌株和碳源依赖性,且在纤维素酶诱导条件下基本上是和3个纤维素酶基因共转录的。
- 尉洪涛陈秀珍陈飞黄建忠董志扬
- 关键词：转录组测序纤维素酶实时荧光定量PCR
