国家自然科学基金(30570357)
- 作品数：10 被引量：48H指数：3
- 相关作者：韩忠朝董春兰陆敏田雪梅刘娜更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院中国医学科学院中国医学科学院中国协和医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Bmi-1沉默对K562细胞功能的影响被引量：3
- 2009年
- Bmi-1是一种转录抑制子,属于Polycomb家族成员之一。Bmi-1基因在调控正常或白血病干细胞的自我更新中起着至关重要的作用。缺乏Bmi-1表达的急性髓系白血病细胞遭遇了增殖阻止和表现了分化和凋亡的征兆,这些发现导致有人提议和认为Bmi-1在白血病治疗中可作为潜在靶点。本研究探讨靶向针对Bmi-1的短发夹RNA(shRNA)对人慢性髓系白血病K562细胞功能的影响。采用RNA干扰技术,构建靶向针对Bmi-1的shRNA真核表达载体,利用脂质体lipofactamine2000将shRNA真核表达载体转染入K562细胞中,经G418(400μg/ml)筛选得到抗性克隆。用PCR和Western blot分别检测转染shRNA后K562细胞中Bmi-1的mRNA和蛋白水平的变化;以MTT法检测干扰组、对照组和未转染组细胞间的增殖情况;以集落形成实验测定3组间集落形成能力。结果表明:在设计的4个shRNA片段中,有1个片段显示显著的抑制效果。该shRNA转染K562细胞后,在mRNA水平上Bmi-1的表达明显下调,Western blot在蛋白水平上也证实了Bmi-1表达显著下调。MTT法和集落形成实验显示了干扰组、对照组和未转染组细胞3者间的增殖能力没有显著差异。结论:抑制Bmi-1的表达并不能减少K562细胞的增殖,这提示了可能存在其它一些平行的信号通路在细胞转化中起重要作用,而且可能独立于Bmi-1的过表达。Bmi-1在慢性髓系白血病的转化中起着次要的作用。
- 陈晓梨任倩陈振萍周泽平赵钦军邱志勇董春兰韩忠朝
- 关键词：BMI-1短发夹RNAK562细胞系细胞周期
- 重组腺病毒介导血小板衍生生长因子感染人类脐带间质干细胞的实验研究
- 2011年
- 目的检测重组腺病毒方法介导血小板衍生生长因子（PDGF）对人类脐带间质干细胞（MSC）的感染能力，为将其用于基因治疗奠定基础。方法反转录．聚合酶链反应（RT—PCR）法扩增人类PDGF的cDNA序列，构建重组病毒载体AdPDGF。分离培养人类脐带MSC。体外以不同感染复数感染MSC后，流式细胞术检测感染效率，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）表达。锥虫蓝染色及四甲基偶氮唑蓝（MTY）法检测感染后细胞生存活力及增殖能力。酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞上清液中PDGF分泌水平。结果成功构建病毒载体AdPDGF。其对MSC的感染效率随感染复数增加而增高，当感染复数为50时，达到最高，为87．36％。未感染的MSC、感染AdPDGF和对照病毒的MSC活力分别为（97．8±2．3）％、（91．9±4．0）％和（92．8±4．0）％，增殖能力分别为（100±16．8）％，（95．9±12．0）％和（87．5±9．7）％，感染AdPDGF的MSC与两个对照比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。感染48h后MSC能有效分泌PDGF，感染复数为10、30、50时，PDGF分泌水平分别为（1．53±0．37）、（3．03±0．68）和（5．25±0．92）ng／ml，MSC—GFP及MSC组未检测到有PDGF分泌。结论成功构建AdPDGF重组腺病毒并高效感染人类脐带MSC。
- 董春兰葛菁梁璐陈小军薛峰韩忠朝
- 关键词：腺病毒科间质干细胞血小板源生长因子
- 骨髓抽提物小粒和单个核细胞分别培养提高间充质干细胞富集效率(英文)被引量：3
- 2010年
- 骨髓是间充质干细胞(MSC)的主要来源。在大多数研究中,先用密度梯度离心法分离出单个核细胞(MNC),再将MNC培养得到MSC。然而,近年来的研究显示,这种标准方法分离MSC的效率并不很高。本研究探讨骨髓抽提物小粒是否是造成该法低效的原因及如何更好地从骨髓抽提物小粒中分离出MSC。选取了20例患者,用标准贴壁法培养MNC,用组织块培养法培养骨髓小粒。对于1-10号患者,先从骨髓抽提物中分离得到MNC,再从剩余的骨髓抽提物中过滤出骨髓小粒,比较从MNC和骨髓小粒培养得到的成纤维样细胞的克隆数量和形态;对于11-20号患者,分离顺序正好相反,比较从MNC和骨髓小粒培养得到的贴壁细胞的免疫表型和功能,对剩余的骨髓抽提物也进行了培养。结果表明:骨髓小粒中的贴壁细胞为MSC。如果先过滤出骨髓小粒,再用密度梯度离心法分离出MNC,然后将二者分别进行培养,则可将骨髓抽提物中的MSC完全分离出来。在密度梯度离心法中大多丢掉的骨髓小粒,是骨髓中MSC的又一重要来源。骨髓小粒可用组织块培养法进行培养。结论:将骨髓抽提物小粒和MNC分别培养可以从单次骨髓抽提物中富集更多的MSC。
- 邢文刘鹏霞刘蒙杨少光赵钦军李建平卢士红任红英黄颖吴昊刘斌张磊韩忠朝
- 关键词：间充质干细胞骨髓小粒单个核细胞密度梯度离心组织块培养
- 造血干细胞的血管分化及其在肢体缺血性疾病中的治疗作用被引量：14
- 2005年
- 造血干细胞是最早发现、研究最深入的组织干细胞,造血干细胞移植已成功治疗了多种血液及免疫性疾病。很早以前,有人推测造血干细胞和血管干细胞来自共同的干细胞-血液血管母细胞。近年研究显示,造血干细胞具有分化血管内皮细胞的能力。动物实验显示,缺血部位造血干细胞移植可以促进血管新生,改善肢体缺血。临床小规模试验研究表明,应用骨髓和外周血造血干细胞移植可以显著促进缺血下肢的血管重建。本文简要介绍骨髓、外周血、脐血造血干细胞的血管分化功能及其在肢体缺血性疾病中的治疗作用。
- 韩忠朝
- 关键词：造血干细胞内皮祖细胞血管新生缺血性疾病干细胞移植
- 采用RNA干扰方法特异性降低胚胎干细胞中Nanog的表达
- 2009年
- 胚胎干细胞是从内细胞团分离得到的一群具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞,发育上的全能性赋予其在临床上广泛的应用前景。对胚胎干细胞全能性机制的研究是其在临床上得以应用的前提和基础。Nanog在胚胎干细胞全能性的维持中起着至关重要的作用,为了更详尽地研究Nanog在胚胎干细胞全能性维持中的作用,我们采用RNA干扰的方法,特异性地降低胚胎干细胞中Nanog的表达,并观察伴随Nanog的表达下降J1细胞的变化。在本试验中,我们设计合成了四条针对Nanog的干扰片段,转染J1细胞,利用RT-PCR、Real-Time PCR、Western印迹检测各个片段对J1细胞中Nanog表达的影响。结果显示,Nanog-P1对J1细胞中Nanog的干扰效率可达90%以上。Nanog表达下降后J1细胞中全能性相关基因utf1的表达显著降低,而分化相关基因gata6的表达有明显升高,说明Nanog在胚胎干细胞的全能性维持中起重要作用。
- 田雪梅刘娜陆敏
- 关键词：胚胎干细胞NANOGRNA干扰全能性
- 逆转录病毒载体转染的人凝血因子Ⅸ基因在人脐带组织源间充质干细胞中的表达被引量：3
- 2009年
- 为了研究逆转录病毒(pLEGFP-N1)转染的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在人脐带间充质干细胞中的表达,应用DNA重组技术将hFⅨcDNA构建入pLEGFP-N1载体,转导入包装细胞系Pheonix细胞,应用病毒上清感染人脐带组织源间充质干细胞(hUCT-MSCs),经G418筛选10天后获得全部的转染阳性细胞,从蛋白质水平和其功能活性上检测hFⅨ的表达。结果显示:配养上清液中可检测到hFⅨ的表达,每24小时分泌量达2.68±0.36μg/106细胞。Western blot检测表明,转导hFⅨ的hUCT-MSCs能分泌预期分子大小的hFⅨ入上清。功能性凝集测定实验表明了转导FⅨ的hUCT-MSCs2天培养上清中hFⅨ的活性为100%-130%。结论:pLEGFP-N1-hFⅨ能有效地转导hUCT-MSCs,并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,这为hUCT-MSCs成为血友病B基因治疗的细胞载体研究奠定了基础。
- 陈晓梨董春兰冯小明陈振萍周泽平许显辉赵钦军邱志勇任倩张蕾韩忠朝
- 关键词：逆转录病毒基因治疗血友病B
- 胚胎干细胞移植治疗帕金森病
- 2008年
- 胚胎干细胞起源于植入前胚胎的内细胞团(innercell mass,ICM),能够在体外进行增殖并能分化成三个胚层的所有细胞类型。如果能有效地将胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)诱导分化为特定的细胞类型,ES细胞将成为细胞替代治疗中供体细胞的一个理想来源,从而可以应用于帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、糖尿病、心肌梗死等的退行性病变疾病的治疗。近年来,将ES细胞来源的多巴胺能神经元用于PD治疗的研究越来越广泛。现对这些研究中有关基因表达调控、实验研究进展、临床应用以及所遇到的问题作一综述。虽然这些研究还没能最终大面积应用于临床,但为PD的治疗提供了一个广阔的应用前景。
- 田雪梅刘娜陆敏
- 关键词：胚胎干细胞细胞替代治疗帕金森病
- 间充质干细胞在治疗皮肤缺损中的应用被引量：1
- 2007年
- 在皮肤组织工程种子细胞的研究中，表皮干细胞在皮肤再生过程中起了至关重要的作用。但是，对表皮干细胞或前体细胞的分离和扩增水平有限，限制了其临床应用。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）可诱导分化为皮肤表皮细胞和血管内皮细胞，并具有独特的生物学特性，如来源广泛、易分离培养扩增及免疫源性低等，使其可能成为皮肤组织工程中的种子细胞，为皮肤缺损临床治疗另辟新径。就MSCs治疗皮肤缺损的临床应用作一概述。
- 景竹春梁璐韩忠朝
- 关键词：间充质干细胞皮肤缺损表皮干细胞分化
- 人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支持造血能力的比较研究被引量：18
- 2009年
- 本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC),比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化MSC。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC-IC(long-termculture-initiatingcells)实验,检测骨髓和脐带间充质干细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA-ABC,不表达HLA-DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MSC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC-IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC(colony forming cell)的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异(p>0.05);第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组(p<0.05)。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论:从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。
- 刘蒙杨少光刘鹏霞杜伟廷顾东生卢士红邢文韩忠朝
- 关键词：骨髓脐带间充质干细胞
- 脐带血移植的应用进展及脐带血库建设被引量：8
- 2007年
- 脐带血(umbilical cord blood)作为公认的造血干细胞重要来源之一,已经被广泛地用于治疗儿童和成人的良恶性血液系统疾病以及中枢神经系统疾病、实体瘤、缺血性下肢血管病和组织再生等。相对于骨髓移植和外周血来源的造血干细胞移植,脐带血移植(UCBT)在细胞收集使用、干细胞增殖能力以及移植物抗宿主反应等方面都具有明显的优势。目前的数据显示,因为HLA配型等原因而无法进行骨髓移植的患者应该尽早进行UCBT。此外,UCBT的增多促进了脐带血库的快速建设。本文针对UCBT和脐带血库的最新进展进行了综述。
- 吴海江朱德琳韩忠朝
- 关键词：脐带血移植脐带血库造血干细胞
