辽宁省自然科学基金(962293)
- 作品数：9 被引量：12H指数：3
- 相关作者：袁凤山吴志香杨立新王大会王玉霞更多>>
- 相关机构：中国医科大学附属第一医院中国医科大学福州大学更多>>
- 发文基金：辽宁省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学化学工程更多>>
- 胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子的克隆与序列分析被引量：2
- 2005年
- 用酚氯仿抽提法提取SD大鼠的肝脏基因组DNA,PCR扩增胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)启动子并克隆至pUC118载体。从含IGFBP-1启动子的质粒中酶切分离出IGFBP-1启动子并测序。PCR扩增出420bp的目的DNA片段,与文献报道的IGFBP-1启动子DNA大小一致。经正、反两方向序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank数据库中的IGFBP-1启动子基因序列一致。以上结果表明克隆成功了IGFBP-1启动子基因,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。
- 吴志香邵敬伟袁凤山
- 关键词：胰岛素样生长因子结合蛋白-11型糖尿病基因治疗
- 含三倍体葡萄糖反应元件的质粒的构建及序列分析被引量：2
- 2005年
- 用酚氯仿抽提法提取SD大鼠肝脏的基因组DNA,PCR扩增单倍体葡萄糖反应元件(glre)。分别用SacⅠ酶单酶切glre、pUC118载体后,连接、转化,PCR筛选出含三倍体glre的质粒并测序。结果PCR扩增出51bp的目的DNA片段,与文献报道的葡萄糖反应元件glre的大小一致;连接转化后,经PCR筛选出三倍体glre,序列分析显示其基因序列和Genbank数据库中的glre基因一致。以上结果表明构建成功含三倍体glre的质粒,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。
- 吴志香邵敬伟袁凤山
- 关键词：亚克隆基因治疗
- 重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移和表达被引量：4
- 2007年
- 目的:探讨含有葡萄糖反应元件的重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移及表达情况。方法:将含有3点突变及2点突变的人胰岛素原基因转染至大鼠肝癌CBRH7919细胞,测定不同葡萄糖浓度下瞬时及用G418筛选稳定表达后胰岛素的分泌量,并检测基因整合情况。结果:①转染后38 h及1个月,不同葡萄糖浓度下,含有3点突变胰岛素原基因的肝癌细胞胰岛素分泌量不同;含有2点突变胰岛素原基因的肝癌细胞,只有在25 mmol/L的葡萄糖浓度培养液中,才能测出胰岛素分泌量;②阳性克隆细胞基因组扩增出特异目的电泳条带,未转染细胞无此条带。结论:①用逆转录病毒为载体能将重组人胰岛素原基因转染到肝癌细胞中,并使之稳定表达。②所构建的重组人胰岛素原基因能指导靶细胞随葡萄糖浓度的变化调节胰岛素分泌。
- 王玉霞袁凤山吴志香杨立新杜宁刘兆喆
- 关键词：葡萄糖胰岛素肝肿瘤基因转移基因表达
- 重组人胰岛素原基因质粒在糖尿病鼠体内表达的安全性初步研究
- 2008年
- 目的初步研究重组人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(RHPGP)在糖尿病大鼠体内的安全性。方法将三碘甲腺原氨酸(T3)和肝细胞生长因子(HGF)注射入糖尿病鼠体内后,导入RHIGP,检测血糖、血清谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN),进行24h饥饿试验以及组织病理学检测和逆转录病毒复制完整型病毒(RCR)的检测。结果实验组大鼠血糖明显下降,饥饿试验中未有低血糖事件发生;实验组动物的ALT、ALB、CRE和BUN与正常组大鼠无统计学差异;病理检测光镜下未见癌细胞及异形核细胞;未检测到野生型逆转录病毒。结论我们构建RHIGP体内表达实现了安全性调控;RHIGP应用于活体动物是安全的。
- 刘囡万勃威袁凤山
- 关键词：安全性基因治疗糖尿病
- 药物和质粒导入途径对提高人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内表达效能的研究
- 2009年
- 目的通过探索药物和质粒导入途径对胰岛素基因表达效能的影响,以期提高以逆转录病毒为载体进行糖尿病基因治疗的效能,为该方法治疗糖尿病的临床实施缩短距离。方法建立链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠模型,通过是否给予HGF、T3和注入重组质粒部位的不同对含有目的基因的重组质粒的转染和整合效率进行干预,观察血糖的控制情况和胰岛素的表达水平,最后提取人鼠的肝脏作RT-PCR,判断目的基因有无表达。结果通过腹腔注入含有目的基因的重组质粒同时给予HGF、T3组的效果最佳,通过尾静脉注入含有目的基因的重组质粒同时给予HGF、T3组效果较佳,仅注入重组质粒组有轻度改善,仅注入HGF、T3组和糖尿病组无任何改善。RT-PCR检测目的基因有表达。结论在动物实验中,应用HGF、T3和通过腹腔注入可明显提高含有目的基因的重组质粒的转染和整合效率,通过胰岛素、血糖的水平和体重的变化来体现。本研究为下一步的临床实验奠定了基础。
- 赵彦冰袁凤山
- 关键词：基因治疗1型糖尿病
- 人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究
- 2005年
- 目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。
- 袁凤山王大会王冰张锦王玉霞吴志香杜宁
- 关键词：定点突变胰岛素样生长因子结合蛋白-1基因重组质粒葡萄糖浓度脂质体介导
- 简捷的PCR点突变实现人胰岛素原基因非β细胞表达被引量：3
- 2004年
- 利用聚合酶链反应 (PCR)技术将人胰岛素原基因进行两处突变 ,引入Furin酶的裂解位点 ,再构建突变人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒 ,转染HepG2肝癌细胞 ,经检测可表达成熟胰岛素。
- 袁凤山杨立新张坤王大会
- 关键词：聚合酶链反应点突变基因表达L型糖尿病
- 人胰岛素原基因胰外表达重组体的构建及鉴定被引量：7
- 2004年
- 目的 :构建胰外表达成熟胰岛素的重组体。方法 :将人胰岛素原基因进行二处突变 ,突变后的胰岛素原基因与逆转录病毒载体 pLXSN重组并转染肝癌细胞。提取肝癌细胞基因组DNA ,PCR方法鉴定人胰岛素原基因与载体重组结果及在肝癌细胞基因组中整合情况。同时测定成熟胰岛素的表达。结果 :胰岛素原基因已整合到肝癌细胞基因组。突变的胰岛素原可被广泛存在的furin酶识别 ,在培养基内检测到较高浓度的成熟胰岛素。结论 :成功构建胰外表达成熟胰岛素的突变人胰岛素原基因逆转录病毒重组体。
- 袁凤山张坤杨立新王大会尤春暖
- 关键词：逆转录病毒载体基因重组基因表达
- 重组人胰岛素基因在大鼠肝癌细胞中的调节表达
- 2006年
- 目的:探讨转染含有葡萄糖反应元件(GLRE)的重组人胰岛素基因大鼠肝癌细胞中不同葡萄糖浓度下胰岛素的分泌情况。方法:利用含有重组质粒[PLXSN-(GLRE)3-BP-1MpINS]的逆转录病毒转染大鼠肝癌CBRH7919细胞,筛选出阳性细胞克隆,调整葡萄糖浓度,测定培养液中胰岛素值。结果:转染后38 h,葡萄糖浓度为0,5,15,25 mmol/L,胰岛素分泌量分别为(5.03±0.72),(9.57±0.49),(32.60±1.96),(43.90±2.30)IU/L,各组间差别显著(P<0.05);转染后1个月,在上述葡萄糖浓度下,胰岛素分泌量分别为(3.57±0.21),(5.30±0.20),(16.27±0.87),(23.23±1.12)IU/L,各组间差别显著(P<0.05)。结论:构建的重组人胰岛素基因具有随培养液中葡萄糖浓度升高调节胰岛素分泌的能力。
- 王玉霞袁凤山吴志香杨立新杜宁王大会
- 关键词：葡萄糖胰岛素
