国家自然科学基金(30570385)
- 作品数：24 被引量：77H指数：6
- 相关作者：郑骏年毛立军刘俊杰温儒民李望更多>>
- 相关机构：徐州医学院附属医院徐州医学院南开大学更多>>
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- G250启动子的克隆及其在人肾癌细胞中的特异生物活性被引量：2
- 2008年
- 目的克隆G250启动子并插入pGL3-Basic真核表达载体，探讨G250启动子在肾癌细胞中的特异生物活性。方法提取宫颈癌Hela细胞总DNA作为模板，设计两对引物进行PCR，获取两段不同长度的G250启动子片段。测序后分别将获取的551bp和218bp启动子片段克隆到pGL3-Basic载体中，构建双荧光素酶检测质粒pGLB-G551和pGLB-G218。将pGL3-Basic、pGLB-G551、pGLB-G218各μg转染G250阳性宫颈癌Hela细胞、肾癌Ketr-3细胞。运用双荧光素酶检测技术，确定G250启动子的转录活性。结果电泳与测序结果显示，两段G250启动子片段与报道序列一致。酶切与测序结果显示，质粒pGLB-G551、pGLB-G218构建成功。转染pGLB-G551、pGLB-G218的Hela细胞相对荧光素酶活性分别为pGL3-Basic的11．07倍、10．36倍。Ketr-3细胞分别为pGL3-Basic的5．17倍、4．13倍。与空载体pGL3．Basic比较，pGLB-G551和pGLB-G218的相对荧光素酶活性均明显增强（P〈0．05）。pGLB-G551和pGLB-G218比较，相对荧光素酶活性差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功克隆出肾癌特异性G250启动子，并证明具有良好转录活性，218bp的启动子片段已具有G250启动子的所有启动效果。
- 薛松郑骏年温儒民郝林毛立军孔德领
- 关键词：启动子克隆肾细胞癌
- 表达白细胞介素-18的溶瘤腺病毒对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用被引量：1
- 2008年
- 目的观察表达IL-18的溶瘤腺病毒（ZD55-IL18）对裸鼠肾癌移植瘤生长及血管形成的抑制作用。方法荷肾癌裸鼠随机分4组，每组8只。瘤体内注射ZD55-IL18、溶瘤腺病毒ZD55-EGFP、表达IL-18的增殖缺陷腺病毒Ad-IL18及PBS，每次注射病毒7×10^8PFU／只，连续注射3d。注射后第7天，每组处死3只取肿瘤组织，免疫组织化学检测肿瘤E1A、IL-18、CD34、VEGF表达及凋亡。第50天时处死动物测量肿瘤体积。结果ZD55-IL18、zD55．EGFP、Ad．IL18及生理盐水处理组肿瘤体积（mm^3）分别为：299．7±52．9、536．8±90．3、570．3-4-99．0、766．1±145．8，ZD55-IL18与各组之间差异有统计学意义（P〈0．01）。Ad-IL18处理组肿瘤无E1A蛋白表达，ZD55-IL18处理组有大量E1A蛋白表达，表明病毒复制。ZD55-IL18处理组肿瘤IL-18表达及凋亡细胞阳性率均显著高于Ad-IL18处理组。ZD55-IL18处理组肿瘤CD34、VEGF表达均显著低于Ad-IL18处理组。结论表达IL-18的溶瘤腺病毒ZD55-IL18比增殖缺陷腺病毒Ad-IL18具有更强的抑制肾癌生长及血管形成作用。
- 陈仁富郑骏年史震李望孙方浩温儒民
- 关键词：溶瘤腺病毒白细胞介素18肾癌
- 溶瘤腺病毒联合化疗治疗肿瘤的研究被引量：1
- 2008年
- 近年来用溶瘤腺病毒联合化疗治疗肿瘤的研究备受人们关注。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是目前临床上有效应用化疗方案的主要限制。溶瘤腺病毒能明显提高传统化疗对肿瘤细胞的杀伤效果，克服了传统肿瘤基因治疗中复制缺陷型腺病毒的转染效率低、靶向性差、抗癌基因表达量低的缺点。在肿瘤治疗中溶瘤腺病毒联合化疗将可能成为潜在有效的临床治疗方案。
- 蒋冠刘彦群郑骏年
- 关键词：肿瘤腺病毒科药物疗法
- 荷载hTERT-siRNA的溶瘤腺病毒对人肾癌细胞增殖的抑制作用被引量：5
- 2008年
- 目的研究荷载hTERT-siRNA的溶瘤腺病毒（ZD-hTERT）对肾癌Ketr-3细胞增殖抑制作用。方法ZD-hTERT、溶瘤腺病毒ZD-EGFP、表达hTERT-siRNA的增殖缺陷腺病毒Ad-hTERT感染人肾癌Ketr-3细胞。Westernblot检测E1A表达；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Westernblot检测hTERT表达；原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡；噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞存活；结晶紫染色法检测细胞毒作用。结果感染ZD-hTERT、ZD-EGFP的Ketr-3细胞表达E1A；抑制hTERT表达作用依次为ZD-hTERT〉Ad-hTERT〉ZD-EGFP。感染ZD-hTERT、ZD-EGFP、Ad-hTERT的Ketr-3细胞凋亡率（％）分别为（65．9±1．4）、（26．5±2．8）、（16．3±3．2）。感染ZD．hTERT、ZD-EGFP、Ad-hTERT的Ketr-3细胞存活率（％）分别为（30．9±3．6）、（51．6±3．8）、（87．9±3．1），每种病毒之间差异有统计学意义（P〈0．01）；对Ketr-3细胞的细胞毒作用ZD-hTERT〉ZD-EGFP〉Ad-hTERT。结论表达hTERT-siRNA的溶瘤腺病毒具有显著的抑制。肾癌Ketr．3细胞hTERT基因表达、诱导凋亡、杀伤肾癌细胞作用。
- 陈仁富郑骏年李望刘艳华毛立军刘俊杰温儒民孙方浩裴冬生
- 关键词：溶瘤腺病毒HTERT基因RNA干扰肾癌
- 抗人肾癌G250单克隆抗体的制备及其功能鉴定
- 2008年
- 目的大量制备、纯化抗人G250单克隆抗体（G250-McAb），并鉴定其与G250合成多肽及细胞天然抗原的结合特异性。方法将抗人G250杂交瘤细胞接种BALB／C小鼠腹腔，大量制备G250-McAb。采用正辛酸-硫酸铵沉淀法获得粗制抗体，然后经蛋白A亲和层析柱纯化抗体。采用荧光激活细胞分类术及免疫组织化学法鉴定G250-McAb与抗原结合特异性。结果成功制备抗人G250-McAb，腹水经纯化后，获得了高纯度抗人G250单克隆抗体，蛋白浓度达4．78g/L。荧光激活细胞分类术及免疫组织化学结果显示G250-McAb与G250表达阳性的Ketr-3细胞特异性结合，而不与G250表达阴性的ACHN细胞结合。结论成功制备并纯化G250-McAb，为进一步开展G250-McAb介导的肾癌诊断、治疗奠定了基础。
- 朱海涛郑骏年李望郑宏祥温儒民刘晓筠刘俊杰裴冬生孔德领
- 关键词：肾细胞癌单克隆抗体细胞结合肾癌诊断
- Ki67基因RNA干扰腺病毒表达载体的构建及其抗结肠肿瘤作用研究被引量：3
- 2007年
- 目的:构建针对肿瘤增殖基因Ki67的小干扰RNA(Ki67-siRNA)腺病毒表达载体,体外研究其对人结肠癌细胞株SW620细胞生长影响,为结肠癌的基因治疗提供参考。方法:设计可形成小发夹结构的Ki67-siRNA对应模板DNA序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pCA13,构建Ki67-siRNA表达质粒pCA13-Ki67。鉴定正确后,将pCA13-Ki67与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染至293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒Ad-Ki67。大量扩增Ad-Ki67,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。Ad-Ki67感染人结肠癌细胞,结晶紫染色法检测细胞病理作用,MTT法检测细胞存活,Western印迹法检测Ki67表达。结果:酶切分析、测序鉴定表明pCA13-Ki67构建成功,PCR分析表明Ad-Ki67含有Ki67-siRNA序列。Ad-Ki67可显著抑制Ki67蛋白表达及结肠癌细胞生长。结论:含有Ki67-siRNA的重组腺病毒构建成功,其能抑制人结肠癌细胞Ki67基因表达和生长。
- 毛立军郑骏年郑宏祥刘俊杰温儒民陈家存孙晓青
- 关键词：KI67基因RNA干扰腺病毒载体
- 增殖及非增殖腺病毒载体介导的RNA干扰对肾癌细胞杀伤作用被引量：6
- 2007年
- 目的比较荷载Ki67基因小于扰RNA(Ki67-siRNA)的增殖腺病毒ZD55-Ki67及非增殖腺病毒Ad-Ki67对肾癌细胞的杀伤作用。方法MOI=10的ZD55-Ki67、Ad-Ki67感染肾癌786-0细胞,2d后收集细胞,蛋白印迹法检测E1A表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白印迹法、免疫细胞化学法检测Ki67表达;原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡。4 d后噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,7 d后结晶紫染色法检测细胞毒性作用。结果感染ZD55-Ki67的786-0细胞表达E1A,感染Ad-Ki67的细胞不表达E1A。ZD55-Ki67、Ad-Ki67感染的786-0细胞Ki67 mRNA表达率分别为(37.9±2.3)%、(64.1±1.9)%;Ki67蛋白表达率分别为(42.5±2.4)%、(60.1±2.2)%;Ki67染色阳性率分别为(20.8±2.8)%、(32.3±2.5)%;786-0细胞存活率分别为(22.2±3.0)%、(60.4±3.4)%;凋亡率分别为(53.0±3.7)%、(35.3±2.5)%,两种病毒处理之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论ZD55-Ki67抑制786-0细胞Ki67表达及增殖、诱导凋亡及细胞毒性作用均显著优于Ad-Ki67。增殖腺病毒介导的RNA干扰杀伤肾癌细胞作用优于非增殖腺病毒。
- 郑骏年毛立军温儒民刘俊杰李望薛松孙晓青韩瑞发马腾骧
- 关键词：腺病毒RNA干扰肾癌
- 携带IL-24基因的溶瘤腺病毒诱导黑素瘤细胞凋亡被引量：4
- 2010年
- 目的探讨携带IL-24基因的溶瘤腺病毒（ZD55-IL-24）诱导人黑素瘤A375细胞凋亡的作用。方法用PCR方法鉴定ZD55-IL-24，并大量扩增、纯化和病毒滴度测定。将ZD55-IL-24感染人黑素瘤A375细胞。结晶紫染色观察细胞毒性，MTr法测定细胞存活率，Western印迹检测溶瘤腺病毒E1A、IL-24基因蛋白表达。结果PCR鉴定表明ZD55-IL-24包含IL-24基因且没有野生型腺病毒污染；结晶紫染色结果表明ZD55-IL-24对A375细胞有明显的细胞毒性效应。M1Tr法结果显示，ZD55-IL-24对A375细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性效应。Western印迹结果表明ZD55-IL-24能在A375细胞内高效表达E1A、IL-24基因。结论溶瘤腺病毒ZD55-IL-24能携带IL-24基因在黑素瘤A375细胞中高效表达，抑制细胞增殖并诱导其凋亡。
- 蒋冠刘彦群郑骏年魏志平毛立军裴冬生
- 关键词：黑色素瘤溶瘤病毒
- 端粒酶与肿瘤治疗研究进展被引量：6
- 2007年
- 由于端粒酶特异地表达于大部分肿瘤细胞,并且为大多数肿瘤细胞持续分裂所必需,因此抑制端粒酶活性就成了一种治疗肿瘤的特异靶点。随着对端粒酶研究的深入,应用靶向端粒酶的方法治疗肿瘤成为热点,并取得了较多的新进展,本文针对端粒酶在肿瘤中的表达调控和靶向端粒酶的肿瘤寡核苷酸治疗、基因治疗、免疫治疗、联合治疗以及干细胞治疗的研究进展进行综述。
- 杨春华毛立军郑骏年刘彦群
- 关键词：肿瘤端粒酶端粒
- 表达小干扰RNA的条件增殖腺病毒与肿瘤
- 2007年
- RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA介导的基因沉默现象。RNAi作为强有力的研究工具正在基因功能组学领域掀起一场真正的革命，也成为当今肿瘤基因治疗研究的热点。条件增殖腺病毒（CRAd）是一类仅在肿瘤细胞内特异增殖新型腺病毒载体，通过CRAd介导的小干扰RNA（siRNA）可以靶向肿瘤细胞，且随着病毒增殖反复表达siRNA，进一步加强siRNA介导的癌基因沉默效果。因此，siRNA-CRAd模式开辟了肿瘤基因治疗的新途径。
- 毛立军郑骏年
- 关键词：RNA干扰肿瘤基因疗法
