南京医科大学科技发展基金(08NMUM009)
- 作品数：3 被引量：5H指数：2
- 相关作者：秦娣卢春王平贾雪梅王子盾更多>>
- 相关机构：南京医科大学江苏省人民医院更多>>
- 发文基金：南京医科大学科技发展基金江苏省高校自然科学研究项目国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探被引量：3
- 2010年
- 目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）病毒蛋白R（Vpr）的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤（PEL）细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR（RT-PCR）检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数（MOI）为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹（Western blot）技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子（Rta）mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.
- 贾雪梅王平秦娣卢春
- 关键词：慢病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒
- HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列的初寻被引量：2
- 2011年
- 目的:构建卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)ORF50启动子系列截短序列克隆,初步寻找HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列。方法:以KSHV基因组为模板,PCR扩增KSHVORF50启动子系列截短序列,克隆至含有虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的基本载体pGL-3中,构建含ORF50启动子系列截短序列的重组Luciferase报告质粒。系列重组报告质粒经酶切鉴定和序列测定分析后,分别转染单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染后的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),进行Luciferase活性检测,计算并比较相对Luciferase活性单位(Relative luciferase activity unit,RLU)。结果:成功分离、克隆KSHV ORF50启动子系列截短序列;HSV-1感染随后转染重组质粒p50-95、p50-46和p50-17与转染p50-1500、p50-750、p50-375及p50-185相比,Vero细胞中Luciferase活性显著下降。结论:成功构建了含KSHV ORF50启动子系列截短序列的重组Luciferase报告质粒;HSV-1所对应的、能够主导ORF50启动子活性的最小顺式调控区位于-185 bp和-95 bp之间。
- 程伟郝婷婷王子盾朱小飞冯宁翰华立新秦娣卢春
- 关键词：KSHVHSV-1虫荧光素酶
- HIV-1 Tat对KSHV感染SK-N-SH细胞的影响
- 2009年
- 目的:初步探索人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)反式激活蛋白(Tat)对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)感染人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH细胞(SK细胞)的影响。方法:将原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞与SK细胞共培养,观察SK细胞的细胞病变效应(CPE)并采用Real-timePCR检测KSHV在SK细胞中的复制。重组质粒Tat+pcDNA3.1(+)和空载体pcDNA3.1(+)分别转染SK细胞,经G418筛选获得抗性克隆,以RT-PCR和Westernblot检测Tat基因的表达。通过BCBL-1细胞与SK-Tat/SK-vector细胞共培养,采用Real-timePCR检测SK-Tat/SK-vector细胞中KSHV裂解期基因ORF50和26的mRNA表达。结果:细胞共培养后,SK细胞出现CPE且SK细胞中检测到KSHV的基因。RT-PCR和Westernblot均在Tat预期位置检测到特异性条带。Real-timePCR检测显示Tat降低KSHVORF50和26mRNA转录水平。结论:初步探索表明,在细胞共培养过程中Tat蛋白抑制KSHV在SK细胞中的复制。
- 周锋秦娣卢春
- 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒HIV-1TAT共培养
