国家自然科学基金(30270342)
- 作品数：15 被引量：43H指数：4
- 相关作者：张德礼孙岩郜原徐志坤温俊歌更多>>
- 相关机构：西北农林科技大学清华大学北京大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金“十二五”国家科技计划农村领域国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生自动化与计算机技术更多>>
- 猪新基因BCL-G_L的克隆与原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：3
- 2010年
- 目的:克隆猪的BCL-GL基因,进行原核表达,并制备出其多克隆抗体。方法:以提交NCBI的人的BCL-GL基因序列为种子序列,对猪的ESTs数据库进行比对拼接,得到contig序列。根据这个序列设计克隆引物,以猪脾脏总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR得到克隆序列。克隆序列经测序验证后,连接到原核表达载体pET-32a,构建成重组表达载体pET32a-BCL-GL,然后将重组载体转化到大肠杆菌BL21进行诱导表达。经His-标签融合蛋白纯化试剂盒纯化得到纯化蛋白制备豚鼠多克隆抗体。结果:抗体ELISA效价为1∶800,Western blot反应特异性良好。结论:成功地克隆了猪BCL-GL基因,并进行了原核表达,制备了特异性豚鼠抗BCL-G血清,为进一步研究其功能奠定基础。
- 蒋朋飞曹金锁柳超赵海平张德礼
- 关键词：克隆原核表达多克隆抗体
- 猪淋巴结PKR基因的克隆与体外初步表达
- 2011年
- 【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pDsRed1-N1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pGEX-PKR在大肠杆菌BL21中的表达情况,用脂质体转染法将真核表达载体pD-sRed1-PKR转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs),Western blot检测其在细胞中的表达。【结果】PCR扩增得到了1 754bp的DNA片段,与预期结果一致;原核表达载体pGEX-PKR和真核表达载体pDsRed1-PKR经双酶切和核酸测序分析,表明载体构建成功;SDS-PAGE检测结果表明,pGEX-PKR重组质粒在大肠杆菌中成功表达;Westernblot检测到pDsRed1-PKR重组质粒在SUVECs中成功表达。【结论】成功克隆了猪淋巴结PKR基因,并在体外初步表达成功。
- 孙岩胡健温俊歌郜原薄联锋徐志坤吴耀丽张德礼
- 关键词：克隆原核表达真核表达
- 猪淋巴细胞趋化因子XCL1的电子克隆和编码区序列RT-PCR验证被引量：5
- 2008年
- 淋巴细胞趋化因子（XCL1）是C族趋化因子的一员，可由CD8＋T细胞、NK细胞、γδT细胞、肥大细胞等多种细胞产生，其趋化性主要作用于CD8＋T细胞和NK细胞。根据猪的EST数据库中猪XCL1基因序列，设计引物采用RT—PCR的方法从猪胸腺中扩增猪XCL1全基因序列，将其连接到pMD-19T载体上并测序，得到猪XCLl基因（GenBank登录号为EU743945）。猪XCL1cDNA大小为333bp，编码由110个氨基酸残基组成的多肽。该多肽序列含Chemokine-C、Chemokine、Chemokine-CC和SCY等功能域，与羊和人的氨基酸序列相似率分别为81．6％和68．4％。预测分析其为分泌蛋白，信号肽剪切位点在21A和22V。猪XCL1基因定位于猪4号染色体（CU468871），基因结构与人XCL1的相似，都由3个外显子组成。该基因ORF翻译起始处基本符合Kozak规则，ORF起始密码子上游同一相位有终止密码子，ORF后有1个加尾信号，预测得到4个可能的启动子，可能性高达85％～98％。总之，通过电子克隆与试验验证，成功地克隆了猪新基因XCL1。
- 宋豪张德礼
- 关键词：电子克隆淋巴细胞趋化因子反转录
- 猪CCL17基因的克隆与原核和真核表达被引量：1
- 2010年
- 【目的】克隆猪胸腺活化调节趋化因子CCL17基因,研究其在原核及真核系统中的表达。【方法】提取仔猪脾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增CCL17,并将其与已知序列的CCL17进行同源性比较;CCL17基因经测序验证后,将其分别克隆入表达载体pET-32a和pEGFP-C1,构建该基因的重组原核表达载体pET-CCL17和真核表达载体pEGFP-CCL17,分别进行双酶切和测序鉴定;前者在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至猪血管内皮细胞(SUVECs),通过绿色荧光标记和Western blot检测细胞中CCL17基因的表达水平。【结果】PCR扩增得到CCL17309bp的DNA片段;重组表达质粒pET-CCL17和pEGFP-CCL17经双酶切鉴定和测序分析证明,载体构建成功。pET-CCL17经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达CCL17融合蛋白,分子质量约32ku,与其理论分子质量基本相符;pEGFP-CCL17转染SUVECs,经Westernblot检测,证实导入的CCL17基因得到了表达。【结论】克隆了猪的CCL17基因,利用大肠杆菌成功表达了CCL17重组蛋白,真核重组质粒在SUVECs中也得到了表达。
- 李燕丽孙柏张亚杰张德礼
- 关键词：胸腺活化调节趋化因子分子克隆原核表达真核表达
- 病毒疫苗制备用不同核型VERO细胞系在裸鼠体内致癌/致瘤性的系统实验研究(英文)被引量：1
- 2004年
- 生产疫苗用细胞系可能具有致瘤性 ,一些常用的细胞系需要检查不同代次有无致癌性。在建立传代细胞种子库与工作库基础上 ,对研制生产病毒活疫苗所用 8株VERO细胞系在 2 19只裸鼠进行了致癌 (瘤 )实验。本研究结果表明 ,VERO细胞染色体核型可发生变异 ,亚四倍体JA株与超二倍体KA株具有强的致癌性 ,不能用于致弱活病毒疫苗制备 ,但可替代HeLa细胞系用作恶性肿瘤阳性对照细胞。筛出无致瘤性的YB、JC、M和JB株亚二倍体VERO细胞系 ,可替代BHK 2 1细胞用于狂犬病减毒活疫苗制备。VERO细胞系染色体遗传相对稳定 ,不同代次变化不大。研究发现细胞染色体遗传特征决定致瘤性质并具有种属特异性 ,不同核型细胞致瘤性不同 ,细胞染色体数目变异大小和致癌性成正相关 ,通过体内外交替选育可在裸鼠体内快速选育成功高变异率肿瘤细胞系。高变异率HeLa或VERO细胞系移植于裸鼠可能产生恶性横纹肌样瘤。因此 ,应当强调疫苗生产用细胞系致瘤性评价的重要性。
- 张德礼季梁李六金黄高升
- 关键词：VERO裸鼠致瘤性
- 猪akirin2基因的克隆与真核表达被引量：4
- 2010年
- Trizol法从猪脾脏中提取总RNA,RT-PCR方法得到猪Akirin2的完整编码区,软件分析猪Akirin2的核酸序列与蛋白序列,进行染色体定位。将Akirin2构建到带有荧光标记的真核表达载体pEGFP-C1中,通过脂质体转染法将pEGFP-Akirin2转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC)中进行表达。结果表明,该序列编码203个氨基酸,猪akirin2基因定位于猪1号染色体,含有4个外显子,猪与牛的Akirin2蛋白高度同源。重组表达质粒pEGFP-Akirin2经双酶切鉴定和测序分析,表明构建成功,pEGFP-Akirin2转染SUVEC细胞后,经荧光检测证实转入的akirin2基因得到表达。研究结果为探讨猪Aki-rin2蛋白在免疫调控中的功能提供了基础数据。
- 曹金锁柳超蒋朋飞赵振华陈新雨张德礼
- 关键词：克隆染色体定位真核表达
- 猪Akirin2基因的定位及其影响IL-1β和IL-6 mRNA表达的研究被引量：4
- 2011年
- 本研究旨在研究猪新天然免疫相关基因Akirin2所表达的蛋白在细胞中的定位,以及在受到外源刺激物LPS刺激时,对细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达的影响。本试验用实验室构建好的pEGFP-Akirin2真核表达载体转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),用激光共聚焦显微镜分析Akirin2在SUVEC的定位,并用LPS作为外源刺激物刺激转染Akirin2基因的细胞,荧光实时定量分析细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量的变化。结果表明,Akirin2基因编码的蛋白严格定位于细胞核之内,并在核仁区有明显表达,在LPS刺激后,Akirin2基因对细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量都具有明显上调作用。本研究证实了Akirin2蛋白的亚细胞定位及其对细胞因子表达的影响,为Akirin2基因的作用机制的进一步研究奠定了基础。
- 徐志坤薄联峰温俊歌孙岩郜原吴江张德礼
- 关键词：LPS细胞定位细胞因子QRT-PCR
- 酵母重复基因在蛋白质互作网络中的分歧进化被引量：1
- 2010年
- 【目的】分析全基因组重复后,蛋白质互作网络对重复基因分歧模式的作用机制。【方法】结合高精度的蛋白质互作数据集和具有相同进化年代的重复基因数据集,在全基因组范围关联分析拷贝间进化距离与网络结构的相关性,并通过对拷贝间连接水平的差异程度分类,分析不同阶段网络结构对基因功能的影响。【结果】重复基因两拷贝间的进化距离与其祖先基因在网络中的连接水平呈显著负相关,与重复基因间的连接度差异率呈显著正相关;网络结构完全歧化的重复基因间的非同义替换均值,较未完全歧化的重复基因显著高出30.2%。【结论】网络结构对重复基因的进化起调节作用,网络系统在保持核心稳定的同时,使外围组分发生了更大变化;重复基因在网络结构改变的前期为基因组提供功能冗余,但在网络结构差别较大后,显著增加的突变更有利于基因新功能的产生。
- 赵振华陈新雨周鹏方郭阳刘敏林文超张德礼
- 关键词：基因重复进化距离连接度酵母
- 猪CDK9基因的克隆及其过表达对SUVEC细胞周期的影响被引量：2
- 2010年
- 【目的】克隆猪细胞周期蛋白激酶9(CDK9)基因,观察该基因过表达对猪脐静脉血管内皮细胞(SU-VEC)周期的影响。【方法】采用电子克隆方法筛选得到猪CDK9基因全长序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出包含完整开放读码框架(ORF)的CDK9 cDNA片段,将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组真核表达载体pEGFP-CDK9。将pEGFP-CDK9以脂质体介导法转染至SUVEC细胞,采用绿色荧光标记和Western blot检测SUVEC细胞中CDK9基因的表达,用流式细胞仪检测转染CDK9基因后SUVEC细胞周期的变化。【结果】得到猪CDK9基因全长1820bp的cDNA序列,其ORF为1119bp,编码372个氨基酸;CDK9分子质量为42.76ku,等电点为9.04;CDK9基因定位于猪的1号染色体上。酶切和测序结果证明,重组真核表达载体pEGFP-CDK9构建成功。pEGFP-CDK9转染SUVEC细胞48h后,荧光显微镜和Western blot检测到目的基因序列在SUVEC细胞中成功表达;试验组各期SUVEC细胞比例与空载体组相比,差异无统计学意义(P>0.05),细胞周期未发生显著变化。【结论】克隆了猪CDK9基因,并在SUVEC细胞中成功进行了表达。CDK9基因的过表达未引起细胞周期发生显著变化,其可能并不参与细胞周期的调控。
- 张亚杰宋豪李艳丽孙柏孙岩张德礼
- 关键词：真核表达细胞周期
- 通过新基因计算机识别与实验确认对NCBI人类基因数据库一些模式参考序列错误的分析与纠正被引量：7
- 2004年
- 采用生物信息学分析与实验确认相结合的技术路线 ,通过所识别的基因在非冗余数据库比对发现了网上公布的计算机注释人类基因组编码序列存在各种类型的多处错误 ,包括cDNA水平的一个或一段碱基插入、缺失或突变 ,或是这些错误的不同排列组合 ,其中以错误插入为多 ,往往导致编码氨基酸的移码突变。最先举证了NCBIGENOMEAnnotationProject预测人类新基因的下列错误类型 :(1)开放读码框架 (ORF)中错误插入一个碱基造成编码氨基酸移码 ;(2 )错误拼接 ;(3)开放读框中错误插入一个或一段碱基造成该读框提前终止。只编码N 端氨基酸的cDNA序列而不完整 ;(4 )只有编码C 端氨基酸序列的cDNA而不完整 ;(5 )只是正确基因ORF中间的一段编码蛋白cDNA序列而不完整 ,缺N 端与C 端氨基酸序列 ,并且将不完整蛋白氨基酸序列的第一个非起始码氨基酸错误地预测为起始码氨基酸 ,如将L错误地预测为M ;(6 )开放读框中错误插入一个或一段碱基造成前面出现不该有的终止码 ,因而编码蛋白缺开头部分氨基酸 ;(7)可能将污染基因组序列当作完整基因cDNA序列对待而预测出所谓单一外显子基因。即便真是基因 ,也只是较长单一外显子mRNA中有一小ORF ,而ORF起始码上游同一相位确实存在终止码 ,无其他特点符合基因条件 ;(8)所预测基因只有ORF ,
- 张德礼季梁李衍达
- 关键词：人类基因组表达序列标签计算机克隆
