江苏省重点学科建设基金(135-03)
- 作品数：18 被引量：28H指数：3
- 相关作者：毕志刚王飞张兆松王群李燕华更多>>
- 相关机构：江苏省人民医院南京医科大学广东省人民医院更多>>
- 发文基金：江苏省重点学科建设基金国家自然科学基金江苏省普通高校研究生科研创新计划项目更多>>
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- 人乳头瘤病毒E7与人干扰素α-2b融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中的表达被引量：1
- 2006年
- 目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)11-E7及人干扰素(IFN)α-2b的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。方法:同时用KpnⅠ、EcoRⅠ酶切pET-32a-IFNα-2b-linker-HPV11-E7及pcDNA3.1,将酶切产物纯化回收,两者的回收产物进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,随机挑选阳性克隆并提取质粒酶切鉴定;用脂质体法转染CHO细胞,用免疫荧光法检测融合基因的表达。结果:DNA测序结果显示,成功地将IFN-α-2b-linker-HPV11-E7装入pcDNA3.1的KpnⅠ、EcoRⅠ酶切位点之间,且其序列与设计完全一致;激光扫描共聚焦显微镜观察可见目的蛋白的表达。结论:成功地构建了HPV11-E7及IFNα-2b的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,为提高DNA疫苗免疫效果的研究奠定了基础。
- 相文忠王飞王群刘丰张兆松苏川毕志刚
- 关键词：人乳头瘤病毒E7基因干扰素Α-2B融合基因
- 紫外线诱导HaCat转铁蛋白受体表达机制的初步探讨被引量：1
- 2006年
- 目的探讨紫外线诱导转铁蛋白受体(TFR)表达的机制。方法以紫外线(UVB)照射HaCat,流式细胞仪检测TFR的表达,realtime-PCR检测TFRmRNA表达。结果UVB可增强TFR的表达,并呈剂量依赖性和时间依赖性。10mJ/cm2的UVB就能促进TFR表达,在紫外线照射后6h开始表达。UVB以剂量依赖性方式诱导TFR的mRNA表达,在UVB照射后8h,TFRmRNA表达水平达高峰,16h开始下降。结论UVB可增强TFR的表达。
- 李燕华毕志刚
- 关键词：紫外线TFRHACAT
- 人乳头瘤病毒11型DNA疫苗协同CD80基因诱导小鼠特异性免疫反应被引量：1
- 2006年
- 目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)11E7、L1-E7 DNA疫苗质粒协同共刺激分子CD80诱导的特异性免疫反应。方法将所构建的pcDNA3.1(+)/HPV11E7、E7-CD80、L1-E7 DNA疫苗质粒分别经肌内注射免疫小鼠,并设L1-E7质粒与CD80质粒共同注射组,PCR和RT-PCR检测质粒DNA的组织分布和目的基因RNA转录,MTT法测脾淋巴细胞增殖活性,ELISA检测脾淋巴细胞培养上清细胞因子的表达水平及血清抗体的水平。结果免疫小鼠后,质粒主要分布在注射部位。DNA疫苗诱导机体产生特异性脾淋巴细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ增加,产生HPV11E7 IgG/L1 IgG抗体;与CD80基因嵌合后,脾淋巴细胞增殖和分泌活性显著增强;与CD80联合免疫组所诱导的细胞免疫反应和体液免疫均显著强于L1-E7单独免疫组。结论HPV11 DNA疫苗能诱导小鼠产生特异性免疫反应,CD80可加强其免疫效果。
- 李莉华黄朝晖郭子健刘志辉任金冬宋明旭周希科王飞毕志刚
- 关键词：乳头状瘤病毒CD80疫苗
- 人IFNα-2b对HPV11-E7 DNA疫苗的免疫佐剂效应
- 2009年
- 目的探讨人IFNα-2b对HPV11-E7DNA疫苗的免疫佐剂效应。方法将28只BALB／c小鼠随机分为4组，每组7只。融合基因组pcDNA3．1（＋）-IFNα-2b—HPV11-E7组，分别肌内注射。初次免疫后2周以同样方法和相同剂量加强免疫，2次免疫后再以同样方法和相同剂量加强免疫。于6周后剖杀BALB／c小鼠，取脾并分离脾淋巴细胞，进行细胞培养并刺激单个核细胞产生细胞因子，用流式细胞仪检测Th1、Th2细胞因子比例。结果融合基因组pcDNA3．1（＋）-IFNα-2b—HPV11-E7组的IFN-γ水平明显高于pcDNA3．1（＋）-HPV11-E7组，差异具有统计学意义（P〈0．001）；融合基因组与pcDNA3．1（＋）-HPV11-E7组的IFN-γ水平明显高于对照组PBS组及空载质粒pcDNA3．1（＋）组，差异有统计学意义（P〈0．001）；两对照组之间的IFN-γ水平差异无统计学意义（P〉0．05）。各组之间的IL-4及IL-10水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论人IFNα-2b能明显加强HPV11-E7的免疫原性，提高免疫小鼠的T淋巴细胞免疫能力，IFNα-2b以增强Th1型应答为主，对Th2型应答无明显影响。
- 相文忠王飞康健王群张蕙张永臣王勇苏川张兆松毕志刚
- 关键词：人乳头瘤病毒干扰素Α-2B
- 紫外线调节血管内皮生长因子分泌机制的研究被引量：2
- 2006年
- 目的:探讨中波紫外线(UVB)增强血管内皮生长因子(VEGF)分泌的信号途径。方法:采用流式细胞仪检测表皮生长因子受体(EGFR)和磷酸化EGFR表达。ELISA检测上清液中VEGF水平。结果:UVB照射后15min可以检测到磷酸化EGFR表达,30min时达最高峰,1h开始下降,2～8h降至基础水平,而EGFR表达量不变。UVB(30mJ/cm2)分别照射EGFR+/-、EGFR+/+和EGFR-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),结果显示EGFR+/+MEF组VEGF分泌明显高于EGFR+/-MEF组和EGFR-/-MEF组,U-VB对EGFR-/-MEF的VEGF分泌促进作用不明显。EGFR磷酸化酶抑制因子PD153035可明显抑制VEGF分泌,1μmol/L有抑制作用,5μmol/L抑制作用增强。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)高度选择性抑制剂LY294002及不可逆抑制剂wortmannin均可明显抑制VEGF分泌。结论:紫外线通过EGFR-PI3K-蛋白激酶(AKT)途径增强VEGF分泌。
- 李燕华毕志刚
- 关键词：紫外线中波磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B
- 人乳头瘤病毒11型L1／E7嵌合DNA疫苗的构建及其诱导的免疫效应
- 2009年
- 目的构建人乳头瘤病毒11型L1／E7嵌合DNA疫苗pcDNA3L1-E7并研究其在小鼠中诱导的免疫效应。方法用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3L1-E7。重组质粒DNA股四头肌注射免疫小鼠，用ELISA方法检测L1、E7特异性抗体和脾细胞分泌的IL-2、γ-INF；MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应。结果成功构建pcDNA3LI—E7。免疫小鼠后，重组质粒可诱导机体产生特异性脾淋巴细胞增殖及IL-2、γ-INF分泌增加，并诱导机体产生HPV11-E7IgG和HPV11-L1IgG抗体。结论嵌合DNA疫苗pcDNA3L1-E7能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应。
- 黄朝晖李莉华郭子健刘志辉任金冬宋明旭周希科王飞毕志刚
- 人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2005年
- 目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列测定及编码氨基酸序列分析,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因,与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7,酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果:克隆出HPV11早期蛋白E6、E7基因,成功构建重组质粒pGEX-6P-1E6、pGEX-6P-1E7。本研究克隆出的HPV11E7基因与GenBank标准株序列完全相同,E6基因有两个位点的变化。结论:本研究克隆出的HPV11E6、E7基因与标准株基本相同,这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。
- 王飞王群毕志刚李光富王新军张兆松
- 关键词：E7基因HPV11人乳头瘤病毒11型蛋白E6基因
- 人乳头瘤病毒11型E6基因与人IFN-α2b融合基因原核表达质粒的构建与鉴定
- 2005年
- 目的构建HPV11E6与人IFNα2b融合基因表达载体,为进一步原核表达奠定基础。方法在IFNα2b的起始密码子之前加入ccatggct,同时以编码(GGSGS)3的45个碱基序列取代其终止密码子,将改造后的人IFNα2b基因人工合成,然后将其装入质粒pET32a的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间;PCR扩增HPV11E6基因片段。将含有IFNα2b基因片段的质粒pET32a和含有BamHⅠ,EcoRⅠ酶切位点的HPV11E6同时用BamHⅠ,EcoRⅠ酶切,将酶切产物纯化回收后做连接反应,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,随机挑选阳性克隆并提取质粒酶切鉴定,同时将挑选的阳性克隆菌液送公司测序。结果测序结果表明成功的将HPV11E6和人IFNα2b通过连接肽(GGSGS)3连接并装入pET32a的NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间,且基因序列与设计完全一致。结论HPV11E6与人IFNα2b融合基因表达载体的成功构建,为进一步原核表达奠定了基础。
- 相文忠王飞李光富王新军刘丰王群张兆松毕志刚
- 关键词：人乳头瘤病毒E6基因IFNΑ-2B融合基因
- 中波紫外线通过EGFR／P13K／AKT途径上调HaCaT细胞转铁蛋白受体的表达
- 2007年
- 目的探讨中波紫外线辐射对HaCaT转铁蛋白受体表达的影响及其信号途径。方法流式细胞仪检测HaCaT细胞转铁蛋白受体的表达。实时PCR检测转铁蛋白受体mRNA表达。结果UVB辐射可上调HaCaT细胞转铁蛋白受体mRNA及其蛋白的表达,并在一定范围内(10 mJ/cm^2～30 mJ/cm^2)呈剂量依赖性。表皮生长因子受体(EGFR)抑制因子PD153035、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制因子LY294002和渥曼青霉素(wortmannin)均可显著抑制UVB辐射对转铁蛋白受体的上调作用(P<0.01)。结论紫外线可通过EGFR/PI3K/AKT途径上调HaCaT细胞转铁蛋白受体的表达。
- 李燕华夏济平王小勇康健孙蔚凌王飞相文忠蒋艺毕志刚
- 关键词：紫外线受体1-磷脂酰肌醇3-激酶受体转铁蛋白
- 角质形成细胞增生行为与p16^(INK4a)蛋白表达和基因失活的相关性研究被引量：8
- 2005年
- 目的:探讨角质形成细胞(KC)增生行为与p16INK4a蛋白表达及其基因失活的相关性。方法:对20例皮肤鳞状细胞癌、24例基底细胞癌、18例Bowen病、12例光线性角化病以及8例脂溢性角化病共计82例患者中具不同增生行为的KC,分别应用免疫组化检测其p16INK4a蛋白表达;应用聚合酶链反应(PCR)、PCR-单链构象多态性以及PCR-限制性内切酶分析方法分别检测p16INK4a基因外显子1和外显子2的缺失、突变和甲基化。结果:p16INK4a蛋白表达的阳性率和表达强度随着KC恶性程度的增加而降低,基因缺失和甲基化是皮肤癌p16INK4a基因失活的主要方式,p16INK4a蛋白失表达与其基因失活是一致的。结论:p16INK4a基因失活在KC恶性转化中起重要作用;p16INK4a基因有可能成为皮肤癌诊断与治疗的一种新靶位。
- 王平毕志刚蒋静娟何杰
- 关键词：角质形成细胞P16^INK4A蛋白P16^INK4A基因基因失活
