重庆市应用基础研究项目(200332)
- 作品数：5 被引量：6H指数：2
- 相关作者：周向东杜先智徐晓艳陈国民杨捷更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第二医院更多>>
- 发文基金：重庆市应用基础研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 细胞外信号调节激酶信号通路在中性粒细胞弹性蛋白酶介导气道黏液高分泌中的作用被引量：3
- 2005年
- 徐晓艳周向东
- 关键词：慢性气道炎症性疾病黏液高分泌弹性蛋白多形核中性粒细胞
- 人肺新型抗蛋白酶性保护因子elafin cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建
- 2007年
- 目的克隆人肺新型抗蛋白酶性保护因子elafin基因cDNA,构建该基因的真核高效表达载体。方法抽提人肺总RNA进行RT-PCR法扩增,产物由pUCm-T载体装载、DNA测序确定后,用双酶切将Elafin cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,转化于大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,双酶切鉴定重组质粒。结果经RT-PCR获得400b的产物,经DNA测序,确定所扩增片段为人elafin基因cDNA,进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-N1-elafin。结论成功构建人elafin基因cDNA真核表达载体,为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基础。
- 杨捷周向东
- 关键词：ELAFIN真核表达载体克隆
- 弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体的构建、鉴定与表达被引量：2
- 2007年
- 目的:构建elafin基因高效表达重组腺病毒载体Ad-elafin。方法:抽提人肺总RNA进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增elafin基因,PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上;在BJ5183细菌内与pAdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定;PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,获得腺病毒载体Ad-elafin;继之在293细胞内扩增,利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率,Western blot检测elafin蛋白的表达,ELISA鉴定elafin蛋白对弹性蛋白酶活性拮抗作用。结果:酶切、PCR、蛋白表达测定及拮抗弹性蛋白酶活性初步鉴定证实弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功。结论:成功构建了重组腺病毒载体Ad-elafin,为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基础。
- 杜先智周向东
- 关键词：腺病毒慢性阻塞性肺疾病
- 弹性蛋白酶保护因子——Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达被引量：1
- 2006年
- 构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.
- 杜先智周向东陈国民
- 关键词：弹性蛋白酶ELAFIN腺病毒穿梭质粒
- Elafin重组腺病毒载体在气道上皮细胞中表达的时相性变化研究被引量：1
- 2007年
- 为研究elafin重组腺病毒表达载体Ad～elafin转染气道上皮细胞的特性，探讨其在上皮细胞中表达的时相性变化，运用①应用原代培养技术培养人气道上皮细胞；②Ad—elafin表达载体转染气道上皮细胞；③在转染后不同的时相中，采用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达，ELISA法单克隆抗体检测细胞上清液elafin蛋白的表达，Northern膜杂交检测elafin基因mRNA的表达量等方法进行研究．发现：①原代培养人气道上皮细胞约5d即可作为靶细胞。②转染Ad—elafin24h时，荧光显微镜下可见上皮细胞内有少量的GFP表达，随着时间的延长，细胞内荧光逐渐增加，96h时GFP荧光阳性的细胞约为80％。③转染24～96h，实验组细胞上清液elafin的含量高于对照组（p〈0．01）；同时elafinmRNA的水平高于对照组（P〈0．05，0．01），且elafin表达及elafinmRNA水平在一定时间内呈时间依赖性关系。结论：Elafin重组腺病毒表达载体Ad—elafin成功转染人气道上皮细胞，目的基因不仅能在上皮细胞中表达，而且elafin蛋白具有细胞外分泌作用．
- 杜先智周向东
- 关键词：ELAFIN上皮细胞气道
