临沂市科技发展计划项目(201013067)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 发文基金：山东省医药卫生科技发展计划项目临沂市科技发展计划项目江苏省现代病原生物学重点实验室开放课题更多>>
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- HPV16-E7 H2P融合钙网蛋白基因重组腺病毒载体疫苗的构建与免疫学鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的构建表达钙网蛋白(CRT)与乳头瘤病毒16型E7基因H2P突变型(HPV16-E7 H2P)融合蛋白重组腺病毒载体(Ad-CRT/HPV16-E7 H2P),为研发新型乳头瘤病毒治疗性疫苗奠定基础。方法首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HPV16-E7 H2P基因融合重组的pJW4303表达载体,将目的基因加上特定的CACC接头后克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆。经过入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应获得表达克隆Ad-CRT/HPV16-E7 H2P。表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到重组腺病毒。结果构建的Ad-CRT/HPV16-E7 H2P经PCR和测序鉴定构建正确;转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.95×1011 pfu/mL,该重组病毒载体能正确表达CRT/HPV16-E7 H2P融合蛋白。结论成功构建了Ad-CRT/HPV16-E7 H2P。
- 刘瑞林马永臻张永东马春玲
- 关键词：钙网蛋白乳头瘤病毒腺病毒表达载体治疗性疫苗
- 钙网蛋白融合HBsAg基因重组腺病毒新型载体疫苗的构建与鉴定
- 2011年
- 目的:构建表达钙网蛋白(calreticulin,CRT)与乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)融合基因重组腺病毒载体(Ad-CRT/HBsAg),为研发新型乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治疗性疫苗奠定基础。方法:采用腺病毒表达系统(ViraPowerTM Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HBsAg基因融合重组的pJW4303表达载体,在构建过程中给融合基因加上特定的CACC接头,再克隆入载体pEN-TR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆Ad-CRT/HBsAg。表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测Ad-CRT/HBsAg载体是否能正确表达目的蛋白。结果:构建的含有CRT/HBsAg融合基因的腺病毒表达克隆,经PCR和测序鉴定构建正确。重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增,获得的病毒滴度为2.68×1011 pfu/ml,且这个重组病毒载体能正确表达CRT/HBsAg融合蛋白。结论:成功构建了CRT/HBsAg融合基因重组腺病毒载体(rAd-CRT/HBsAg),为此重组载体用于治疗HBV慢性感染以及HBsAg阳性肝癌奠定基础。
- 张兰春王宝红王芳马春玲
- 关键词：钙网蛋白乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒表面抗原腺病毒表达载体治疗性疫苗
