山东省自然科学基金(ZR2011HZ002)
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
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- CXCL12及AMD3100对神经母细胞瘤细胞增殖及转移的影响
- 2013年
- 目的探讨CXCL12（SDF-1，基质细胞衍生因子-1）对神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）细胞体外增殖及迁移的影响及CXCL12受体拮抗剂AMD3100对其阻断作用。方法用浓度为100ng／mlCXCL12刺激人神经母细胞瘤细胞系QDDQ-NM、SK—N-SH、SH—SY5Y三组细胞，MTT法检测CXCL12对神经母细胞瘤细胞增殖的促进作用。用不同浓度的CXCL12（0、30、50、100ng／m1）诱导三组细胞，Transwell体外趋化迁移实验检测三组神经母细胞瘤细胞迁移能力，再用100ng／mlAMD3100孵育三组细胞后应用CXCLl2诱导，Transwell体外趋化迁移实验检测三组神经母细胞瘤细胞迁移能力的变化。结果MTT结果示在一定时间范围内，CXCL12可促进QDDQ-NM、SH—SY5Y神经母细胞瘤细胞增殖，效果随着时间的延长而增强，在48h时，促进增殖效应达最大，与空白调零组及空白对照组比较有明显差异（P〈0．05）。Transwell体外趋化侵袭实验表明：CXCL12可促进QDDQ-NM、SHSY5Y神经母细胞瘤细胞的迁移能力，迁移细胞数明显高于对照组（P〈0．05），在一定范围内，CXCLl2为50g／ml时作用最强（P％0．01）；且AMD3100均可抑制三组细胞迁移能力（P〈O．05）。结论CXCR4-CXCLl2生物学轴在神经母细胞瘤细胞增殖及嗜器官特异性转移侵袭过程中发挥了重要作用，而AMD3100可阻断神经母细胞瘤的增殖、侵袭能力。
- 姜忠关鸽陈鑫王莉张虹江布先董蒨
- 关键词：趋化因子CXCL12神经母细胞瘤肿瘤转移
- miR-203靶定CAMTA1基因调控神经母细胞瘤细胞的迁移能力被引量：1
- 2014年
- 目的本研究旨在探讨miR-203在神经母细胞瘤组织中的表达水平及其在神经母细胞瘤细胞迁移过程中的作用机制。方法在神经母细胞瘤细胞中转染miR-203抑制剂，通过Transwell迁移实验研究其对迁移的影响。利用生物信息学技术预测miR-203的靶基因，并应用荧光报告基因检测、实时荧光定量PCR及WesternBlot对靶基因进行验证。采用siRNA干扰技术抑制靶基因CAMTA1的表达，共转染miR-203抑制剂及CAMTA1 siRNA，验证miR-203是否是通过靶基因影响细胞迁移。最后应用荧光定量PCR方法检测原发性和转移性神经母细胞瘤样本中miR-203的表达。结果神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y和SK-N-SH中抑制miR-203表达后，与转染miR抑制剂对照相比，细胞迁移数目分别降低了41．34％和37．86％（P〈0．05）。miR-203能够直接靶向结合CAMTA1mRNA的野生型圳TR，转染miR-203抑制剂后，SH-SY-5Y和SK-N-SH细胞中内源性CAMTA1蛋白表达分别是转染miR阴性对照的2．13和1．78倍。（P〈0．05）。转染过表达CAMTA1质粒，SH-SY-5Y和SK-N-SH细胞迁移数目分别下降了25．27％和19．48％（P〈0．05）。在SH-SY5Y细胞中，同时共转miR-203抑制剂和CAMTA1 siRNA，与单纯转染miR-203抑制剂相比，细胞迁移能力增高了19．37％和（P〈0．05），与单纯转染抑制剂对照组相比，无统计学差异（P〈0．05）。与原发性神经母细胞瘤相比，在转移性神经母细胞瘤中，miR-203表达水平更高（P〈0．05）。结论miR-203与神经母细胞瘤样转移性相关，并且能够通过靶定CAMTAl基因影响神经母细胞瘤细胞的迁移能力。
- 刘志洋刘伟伟孙梅陈鑫韩芦芦董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤RNA小分子干扰
- miR-144通过靶定ITGβ1调控神经母细胞瘤的侵袭转移被引量：2
- 2017年
- 目的 本研究旨在探讨miR-144对神经母细胞瘤的侵袭和转移的影响,并探索miR-144是否通过靶定ITGβ1调节神经母细胞瘤的侵袭和转移.方法 利用生物信息学技术预测miR-144的靶基因ITGβ1,应用荧光报告基因检测以及荧光定量PCR、Western Blot实验对靶基因进行验证.在神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-BE分别瞬时转染化学合成的成熟双链miR-144和靶基因敲降质粒及对照质粒,建立过表达miR-144细胞模型和靶基因敲降细胞模型.通过 Transwell侵袭实验和划痕实验检测细胞的体外侵袭和转移能力.结果 Transwell实验结果表明,在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和SK-N-BE中过表达miR-144后,细胞的侵袭数目分别为41±2和55±2,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.01）.抑制ITGβ1基因的表达后,体外划痕实验结果表明,过表达miR-144后,与对照组相比,SH-SY5Y和SK-N-BE细胞的转移能力分别下降了65.45%和75.41%（P〈0.01）.荧光报告基因检测结果显示过表达miR-144后,含有结合位点的荧光报告质粒的相对荧光量降低了37.11%（P〈0.01）,而将结合位点进行基因突变后miR-144对靶基因的抑制作用消失.过表达miR-144后,与对照组相比,SH-SY5Y和SK-N-BE细胞内的ITGβ1 mRNA水平分别降低了40%和43%,Western Blot检测结果显示,ITGβ1蛋白水平分别降低了39%和40%.结论 miR-144通过靶定ITGβ1基因抑制神经母细胞瘤的侵袭和转移过程.
- 吴翮徐升公红磊韩芦芦陈鑫
- 关键词：神经母细胞瘤
- miR-338—3p对神经母细胞瘤增殖和侵袭的抑制作用被引量：5
- 2013年
- 目的探讨microRNA-338—3p（miR-338—3p）对神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和SK-N-MC增殖、侵袭和迁移能力的影响，miR靶基因的确定及靶基因功能的研究。方法miRNA芯片结果发现miR在神经母细胞瘤中低表达，利用实时定量PCR验证其结果。利用脂质体Lipofectamine TM2000将miR-338—3pmimics和miR-338—3p的反义寡核苷酸链（ASO）以及对照质粒分别瞬时转染SK-N-SH和SK-N-MC两种细胞系，MTT法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力，Transwell实验检测细胞的体外侵袭和迁移能力。利用生物信息学技术预测miR-338—3p的靶基因，并应用EGFP荧光报告载体实验，实时荧光定量P（’R和Westernblot实验对靶基因进行验证。并利用实时定量PCR检测神经母细胞瘤中靶基因的表达。最后，将靶基因的敲降质粒和过表达质粒以及对照空质粒分别瞬时转染细胞，MTT法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力，Transwell实验来检测细胞的体外侵袭和迁移能力。结果实时定量PCR显示与癌旁正常组织相比，miR-338-3p在神经母细胞瘤细胞中低表达（P〈0．01）；癌细胞转染miR-338-3pmimics后，细胞活性、克隆形成能力、侵袭和迁移能力与对照组相比是减弱的（P〈0．01），而在转染了miR-338-3p的AS（3封闭miR-338—3p的表达后，细胞活性、克隆形成能力、侵袭和迁移能力与对照组相比是增强的（P〈0．01）。利用生物信息学方法将RAB14基因作为miR-338—3p的候选靶基因，EGFP荧光报告载体实验显示过表达miR-338—3p可以抑制含有miR-338-3p结合位点的报告载体的荧光量（P〈0．01），而将结合位点的碱基进行突变后miR-338-3p对靶基因3’UTR的抑制作用则消失。实时荧光定量PCR和Westernblot结果表明过表达miR-338-3p可以同时在mRNA和蛋白水平上抑制RAB14的表达（P〈0．01），而用ASO抑制miR-338—3p的表达后RAB14的水平升高（P〈0．01）。实时定量PCR
- 鹿洪亭董蒨陈鑫张虹郝希伟韩芦芦
- 关键词：神经母细胞瘤细胞增殖微RNAS
- miR-93对神经母细胞瘤细胞侵袭和迁移的影响及机制研究被引量：10
- 2015年
- 目的研究miR-93对神经母细胞瘤细胞侵袭和迁移能力的影响及可能的分子机制。方法收集13例确诊的神经母细胞瘤患儿原发部位和转移部位组织样本，利用实时定量PCR的方法检测样本中miR-93的表达水平。在神经母细胞瘤细胞SH—SY5Y和SH—N-SH细胞中转染miR-93mimic，转染24h后利用实时定量PCR技术检测SH—SY5Y和SH—N-SH中miR-93的表达水平。利用Transwell侵袭实验检测过表达miR-93后对细胞侵袭能力的影响。利用体外划痕实验检测过表达miR-93对细胞迁移能力的影响。利用Western blot方法检测过表达miR-93mimic后SH—SY5Y和SH-N-SH细胞中MYCN蛋白表达水平。在Targetscan中找出可能与miR-93作用的MYCN的3’UTR序列，设计合成野生型与突变型MYCN的3’UTR的PCR引物，构建野生型与突变型荧光素酶报告载体，用X-tremeGENE将荧光素酶报告载体分别与miR-93mimic共转染到SH—SY5Y细胞中，用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，验证miR-93对MYCN的靶向调控作用。结果与原发性神经母细胞瘤相比，miR-93在转移瘤中表达显著降低。过表达miR-93后SH—SY5Y和SH—N-SH细胞侵袭和迁移能力显著降低。过表达miR-93后，SH-SYSY和SH-N-SH细胞内MYCN蛋白表达下调。荧光素酶活性检测表明miR-93能够抑制MYCN的荧光素酶活性。结论MiR-93能够通过负调控MYCN而抑制神经母细胞瘤细胞侵袭和迁移能力。
- 陈鑫韩芦芦姜忠郝希伟段于河张虹董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤肿瘤转移荧光素
- 神经母细胞瘤裸鼠原位荷瘤细胞系与转移瘤细胞系生物学异质性分析被引量：1
- 2015年
- 目的利用本实验室建立的神经母细胞瘤体外细胞系，建立神经母细胞瘤荷瘤鼠原位荷瘤与转移瘤模型，并用原位荷瘤及转移瘤分别建立细胞系，比较原位荷瘤及转移瘤的差异，从而验证神经母细胞瘤的肿瘤异质性。方法利用本实验室建立的神经母细胞瘤细胞系，制备单细胞悬液，通过Typlan细胞计数法，调整细胞浓度为1～9×10^7／mL。接种于裸鼠皮下，建立荷瘤鼠原位荷瘤与转移瘤模型，并用原位荷瘤及转移瘤分别建立细胞系，通过细胞生长的测定、软琼脂克隆形成以及免疫组织化学检测和裸鼠成瘤实验等方法，比较两种细胞系的差异。结果在原位荷瘤及转移瘤细胞株中，转移瘤细胞株在增殖能力、克隆形成能力及肿瘤细胞成瘤能力方面均明显高于原位荷瘤细胞株。结论裸鼠原位荷瘤及转移瘤两株细胞具有明显差异，证明神经母细胞瘤肿瘤具有异质性，这种异质性可能是神经母细胞瘤转移的重要原因。
- 李富江鹿洪亭董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤动物实验
- 神经母细胞瘤组织中HOXC9蛋白的表达与肿瘤发展及预后的关系被引量：1
- 2014年
- 目的探讨小儿神经母细胞瘤组织中同源盒基因(HOX)C9蛋白的表达与肿瘤发展及预后的关系。方法神经母细胞瘤患儿112例,手术中留取肿瘤组织,免疫组化染色法检测瘤组织中的HOXC9蛋白,分析其表达与神经母细胞瘤临床病理参数的关系;随访78例患儿,通过Kaplan-Merier法建立生存曲线,分析HOXC9蛋白表达量与患儿生存时间的关系。结果神经母细胞瘤组织中HOXC9蛋白的表达与患儿年龄及肿瘤临床病理分期、细胞分化程度、转移情况有关(P均<0.05);HOXC9蛋白表达与神经母细胞瘤患儿的生存时间有关(P<0.01)。结论HOXC9蛋白与神经母细胞瘤的发展和预后相关。
- 朱永洁陈鑫邴春梅张琳董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤同源盒基因
- miR-195通过靶定RET调控神经母细胞瘤的侵袭被引量：2
- 2015年
- 目的神经母细胞瘤是儿童常见的恶性疾病，转移是致死的主要因素，其中微小RNA（microRNA，miRNA）在该疾病的转移中具有很重要的作用。本研究旨在探索miR-195是否通过RET调节神经母细胞瘤细胞的侵袭。方法在神经母细胞瘤细胞中转染mimicscontrol和miR-195mimics，建立过表达miR-195的细胞模型。通过Transwell侵袭实验研究过表达miR-195对侵袭的影响。利用生物信息学检测miR-195的靶基因，并应用荧光素酶报告基因鉴定其对靶基因31UTR的结合序列。实时定量PCR及western检测过表达miR-195对靶基因mRNA及蛋白的改变。应用siRNA干扰建立抑制靶基因的细胞模型，通过Transwell侵袭实验检测敲减靶基因对侵袭的影响。最后建立恢复靶基因表达的细胞模型，通过Transwell侵袭实验验证能力的恢复。结果在SH-SY5Y和SK-N-SH内，均成功过表达miR-195的相对水平分别为34±1．19和43±1．71，与对照组相比具有显著差异（P〈O．001）。SH—SY5Y过表达miR-195后发生侵袭的细胞数由93±2降至62±1，SK-N-SH过表达miR-195后发生侵袭的细胞数由82±2降至56±5，过表达miR-195后显著抑制细胞侵袭（P〈0．05）；生物信息学检测miR-195能够结合RETmRNA的3’UTR。过表达miR-195显著抑制RET的mRNA和蛋白质水平（P〈O．05）。过表达miR-195显著抑制报告质粒RET3’UTRwT的荧光素酶的相对活性（P〈O．05）。RNA干扰均抑制两种细胞内RET（一个在转化中发生重排的原癌基因，RET原癌基因）的mRNA和蛋白的水平（P〈0．05）。在SH-SY5Y内，敲减RET后发生侵袭的细胞数目由89±2降至62±5，在SK-N-SH中由78±2降至63±1，均具有显著差异（P〈0．05）。在恢复实验中，对照组和实验组发生侵袭的数目分别为84±3、64±9、65±5和82±1，恢复RET表达恢复细胞的侵袭能力。结论miR-195与神经母细胞瘤侵袭能力相关，并且能够通过靶向RET调节神经母细胞瘤�
- 朱永洁陈鑫韩芦芦段于河董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤转染
- miR-142-3p调控高迁移率族蛋白1及对神经母细胞瘤顺铂化疗敏感性的影响被引量：3
- 2015年
- 目的 研究miR-142-3p靶向调控高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）及其对神经母细胞瘤细胞顺铂（CDDP）化疗敏感性影响的分子机制.方法 ①构建神经母细胞瘤耐药细胞株SH-SY5 Y/CDDP,RT-PCR检测细胞内miR-142-3p的表达水平;②CCK8和Elisa检测过表达miR-142-3p对耐药细胞株SH-SY5 Y/CDDP的凋亡和IC50水平的影响;③构建HMGB1 3＇UTR区荧光素酶报告载体,验证miR-142-3p对HMGB1的靶向调控作用;④Westernblot检测转染miR-142-3p后SH-SY5Y细胞中HMGB1的表达水平;⑤利用siRNA敲减耐药细胞株SH-SY5 Y/CDDP中HMGB1的表达,Western-blot检测siRNA的敲减效果,CCK8和Elisa方法检测SH-SY5 Y/CDDP细胞的IC50和凋亡情况.结果 ①构建神经母细胞瘤耐药细胞株SH-SY5 Y/CDDP成功,耐药细胞株IC50由原来的（4.57±0.65） μg/ml增加到（23.53±3.87） μg/ml,比非耐药细胞株提高了5.15倍;RT-PCR结果显示耐药的SH-SY5Y/CDDP细胞株中miR-142-3p表达水平显著低于正常的SH-SY5Y细胞,差异有统计学意义（P＜0.01）.②Elisa结果显示,过表达miR-142-3p后,与转染Control mimics组相比,耐药细胞株SH SY5Y/CDDP细胞用CDDP处理后凋亡水平升高,IC50显著降低（7.02±1.38 vs 24.27±4.13）μg/ml,差异有统计学意义（P＜0.05）;③荧光素酶活性检测表明miR-142-3p能够显著抑制HMGB1的荧光素酶活性（P＜0.01）;④Western-blot结果显示,在SH-SY5Y细胞中过表达miR-142-3p后,细胞中HMGB1蛋白水平明显下调（P＜0.01）,miR-142-3p与HMGB1的表达呈负相关;⑤两条siRNA敲减HMGB1后,SH-SY5 Y/CDDP耐药细胞株用CDDP处理后凋亡水平升高,细胞的IC50由对照组的（24.61±4.07） μg/ml,分别下降到（9.65±1.39）μg/ml和（8.43±1.76）μg/ml,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 miR-142-3p的靶基因为HMGB1,miR-142-3p能够通过靶向调控HMGB1的表达而增加神经母细胞瘤细胞对CDDP化疗的敏感性.
- 周显军陈鑫沈峰董蒨朱永洁段于河耿耿崔楷悦李晓
- 关键词：神经母细胞瘤基因表达调控
