国家自然科学基金(81000720)
- 作品数：15 被引量：30H指数：4
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- EV71 VP1黏膜疫苗制备及其诱导黏膜免疫的实验研究被引量：4
- 2011年
- 目的研究表面展示肠道病毒71型(EV71)结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢制备疫苗的可行性及应用价值。方法以表面展示EV71 VP1蛋白的重组枯草芽孢杆菌及野生型同基因株枯草芽孢杆菌制备疫苗,并分别通过灌胃+滴鼻途径免疫BALB/c小鼠(观察组和对照组各16只),4周后摘眼球取血,脱臼处死小鼠收集肺泡及小肠冲洗液,采用ELISA方法检测血清、肺黏膜、肠黏膜中VP1特异性IgA抗体水平。结果枯草芽孢杆菌经培养及溶菌酶处理后均以芽孢形式存在;观察组血清及肺黏膜中VP1特异性IgA抗体水平均显著高于对照组(P均<0.01),但两组肠黏膜中抗体水平无显著差异。结论展示EV71结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌芽孢可成功制备疫苗,且能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应;此为EV71疫苗的研制提供了新思路。
- 李志会岳盈盈李鹏宋楠楠孟红
- 关键词：肠道病毒71型
- 枯草芽孢杆菌芽孢佐剂免疫途径及效果的动物实验观察被引量：1
- 2013年
- 目的探讨以表面展示免疫球蛋白结合蛋白功能域(FDIBP)的枯草芽孢杆菌芽孢制备的黏膜佐剂不同途径免疫的应用效果。方法分别将表面展示FDIBP的重组枯草芽孢杆菌芽孢及大肠杆菌不耐热毒素(LT)与人IgG(hIgG)作为佐剂共孵育制备疫苗,通过灌胃、滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,5周后收集外周血、肺泡、小肠及阴道冲洗液。采用ELISA方法检测血清中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、抗hIgG特异性IgG抗体,同时检测血清及肺泡、小肠、阴道冲洗液中抗hIgG特异性IgA抗体水平。结果与无佐剂免疫者比较,枯草芽孢杆菌芽孢佐剂滴鼻能有效提高小鼠体液免疫产生的抗原特异性抗体IgA及IgG水平(P<0.01),但未能有效刺激细胞免疫上调血清IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平;通过灌胃途径免疫者上述特异性抗体及细胞因子水平均无显著变化(P均>0.05)。结论展示FDIBP的枯草芽孢杆菌芽孢可用作滴鼻途径黏膜疫苗佐剂,能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应。
- 李志会李鹏岳盈盈宋楠楠纪璇曹银光孟红
- 关键词：黏膜佐剂
- 肠道病毒71型感染对BALB/c乳鼠T淋巴细胞亚群的影响
- 2013年
- 目的观察BALB/c乳鼠感染肠道病毒71型(EV71)后机体的免疫功能状态,为临床治疗提供依据。方法将30只1日龄BALB/c乳鼠随机分为对照组、实验组1组和实验2组,分别颅内注射20μL灭活EV71200804株、EV71200804株和EV71200803株;感染后7 d后引颈处死小鼠,取胸腺和脾脏,分离淋巴细胞进行T细胞亚群检测。结果与对照组比较,实验1组胸腺淋巴细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+细胞百分比均明显升高(P均<0.05),实验2组各T淋巴细胞百分比略有升高(P均﹥0.05);实验1组脾脏淋巴细胞中CD+3CD+4、CD+3CD+8和CD+3细胞百分比均显著降低(P均<0.01),实验2组CD3+CD4+细胞百分比明显降低(P<0.05)、CD3+CD8+和CD3+细胞百分比无显著变化(P均﹥0.05);实验1组和实验2组胸腺CD4+ T细胞/CD8+T细胞均略低(P均﹥0.05),实验1组脾脏CD4+ T细胞/CD8+ T细胞略高、实验2组略低(P均﹥0.05)。结论 EV71感染可引起BALB/c乳鼠T淋巴细胞亚群功能紊乱,且其程度与病毒株有关。
- 宋楠楠岳盈盈李志会李鹏纪璇孟红
- 关键词：肠道病毒71型BALBT细胞亚群
- 两株不同毒力EV71全基因组序列测定及分析被引量：4
- 2012年
- 目的了解济南市2008年EV71的流行和变异情况,寻求潜在的EV71毒力决定位点。方法采用分段扩增的RT-PCR方法对EV71JN200803和JN200804株的基因组全长进行扩增、测序。对两株EV71的全基因组核苷酸、氨基酸序列进行比较,对非编码区进行RNA二级结构的预测和分析,并对VP1区和全基因组进行遗传进化分析。结果 EV71JN200803和JN200804株的基因组全长分别为7 405nt和7 404nt,编码区没有核苷酸的插入和缺失,全基因组序列的组成和结构均符合肠道病毒71型的特征。JN200803和JN200804全基因组有106个核苷酸突变,编码区98个,非编码区8个,编码区多数属于同义突变,仅造成16个氨基酸突变。遗传进化分析显示,EV71JN200803和JN200804株与2008年国内其他流行株同属C4亚型的C4a进化分支,与Fuyang/17.08/1株进化关系最近。结论 2008年济南市流行的EV71属于C4a亚型,济南分离株的毒力决定位点不但具有非单一性,而且具有较为独特的济南区域特点。
- 李鹏宋楠楠岳盈盈李志会张颖盖中涛孟红
- 关键词：EV71毒力全基因组
- 不同毒力EV71济南分离株全基因组序列比较分析被引量：2
- 2013年
- 目的研究EV71济南分离株的基因特点,寻找潜在的EV71毒力决定位点。方法将6株EV71济南分离株(JN200803、JN200804、Jinan1002、Jinan1004、Jinan1005和Jinan1006株)分别接种1d龄BALB/c小鼠,确定其对小鼠的致病性程度。对6株EV71全基因组核苷酸、氨基酸序列进行比较,对非编码区进行RNA二级结构的预测和分析,对VP1区进行遗传进化分析。结果通过动物实验可将6株EV71济南分离株分为强、中、弱毒力株。小鼠感染强毒株(JN200804、Jinan1002、Jinan1004、Jinan1005株)的主要症状为后肢麻痹并死亡,感染弱毒株(Jinan1006株)的主要症状为后肢麻痹但能自愈,感染无毒株(JN200803株)未引起明显症状。不同毒力EV71分离株全基因组序列比对发现,共有40个核苷酸位点的差异,导致编码区8个氨基酸突变,其中第937位氨基酸(位于2A片段)在强毒株、弱毒株和无毒株间发生了连续突变(937aa:S→C→G)。非编码区RNA二级结构预测表明,5′UTR第115位核苷酸突变对内部核糖体进入位点(IRES)的结构有较大影响。遗传进化分析显示,与国内2003年以后的流行毒株相同,6株EV71济南分离株均属C4亚型的C4a进化分支。结论全基因组序列比较分析发现不同毒力EV71济南分离株之间存在差异位点,为采用反向遗传学方法鉴定EV71毒力决定位点奠定了基础。
- 李鹏李志会岳盈盈宋楠楠纪璇张颖盖中涛孟红
- 关键词：EV71毒力全基因组
- 制备肠道病毒71型黏膜疫苗的初步探索被引量：1
- 2012年
- 目的利用同源重组技术将肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因重组入枯草芽胞杆菌基因组,进而将VP1蛋白展示在其芽胞表面制备EV71黏膜疫苗。方法将枯草芽胞杆菌CotB基因与VP1基因连接后插入整合质粒pDG1662,得到重组质粒pDG1662-CotB-VP1,电转化法转化枯草芽胞杆菌1A771,抗生素抗性筛选,PCR、Westernblot、免疫荧光鉴定VP1基因重组及蛋白表达情况。结果 VP1基因成功重组入枯草芽胞杆菌基因组中,VP1蛋白在芽胞表面得到了有效表达。结论 EV71衣壳蛋白在枯草芽胞杆菌芽胞表面得到了有效表达,为研究EV71黏膜疫苗奠定基础。
- 李志会岳盈盈宋楠楠李鹏孟红
- 关键词：肠道病毒71型黏膜疫苗
- 小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物被引量：5
- 2014年
- 小RNA病毒科是一类大的动物病毒科,小RNA病毒蛋白的合成需要自身蛋白酶裂解形成多个结构蛋白和功能蛋白,3C蛋白酶是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一,3C蛋白酶还可以裂解一些宿主的蛋白,利于病毒的复制。3C蛋白酶结构特点、活性中心、酶切位点如何,裂解的底物功能怎样,是进一步了解3C蛋白酶作用机制的关键。就这些问题进行综述。
- 刘艳李冰清孟红
- 关键词：小RNA病毒
- 肠道病毒71型2C蛋白的异源表达及纯化
- 2014年
- 目的获得高纯度、性状均一的可溶蛋白肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)2C。方法截取2C蛋白的6个包含ATPase/解旋酶等核心结构域的基因片段,分别使用含有His标签和MBP促溶标签的表达载体在大肠埃希菌中进行异源表达,分子筛层析纯化2C蛋白,SDS-PAGE电泳检测表达产物和纯化蛋白。结果成功将EV71 2C蛋白的6个片段进行了克隆表达并纯化,获得了高纯度、性状稳定的可溶蛋白MBP-2C91aa-256aa和MBP-2C118aa-256aa。SDS-PAGE检测2C蛋白纯度达97%以上,分子质量与预期结果一致。纯化的2C蛋白浓度为8.8mg/ml。结论91aa-256aa和118aa-256aa片段的MBP-2C截短蛋白比包含其他片段的截短蛋白性状稳定、均一,MBP标签提高了2C的6个截短蛋白的可溶性。高纯度可溶蛋白的制备为其晶体结构和功能研究奠定了基础。
- 刘艳李志会李鹏岳盈盈宋楠楠秦立增李冰清孟红
- 关键词：异源表达
- 重症手足口病患者气管插管吸出液中肠道病毒71型的分离与鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的分离鉴定重症手足口病患者气管插管吸出液标本的EV71病毒株。方法将采集的标本过滤除菌接种于MA104细胞,出现细胞病变效应(CPE)后提取培养上清液中的RNA,用国家标准检测引物进行RT-PCR鉴定;用特异性引物进行PCR获得VP1全序列,测序后以MEGA4软件与各血清型代表株VP1序列进行分析并构建分子进化树。结果接种标本3 d后细胞出现CPE,经RT-PCR鉴定为EV71,对其VP1全序列进行测定分析后,确定其为C4亚型,并绘制了分子进化树。结论手足口病患者下呼吸道分泌物EV71的分离鉴定,为手足口病肺损伤发病机制的研究提供了依据。
- 岳盈盈张颖李鹏李志会宋楠楠纪璇盖中涛孟红
- 关键词：肠道病毒A型手足口病病毒培养
- EV71不同接种途径对BALB／c小鼠的感染特点被引量：2
- 2013年
- 目的研究EV71JN200804株对1日龄BALB／c小鼠的感染特点，建立EV71感染BALB／c小鼠的动物模型，为疫苗和抗病毒药物的研究提供可靠的动物评价工具。方法EV71JN200804株分别采用口服、颅内注射、肌内注射和腹腔注射感染1日龄BALB／e小鼠，出现后肢麻痹后，做后肢电生理检测；安乐动物，采集脑、脊髓、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、小肠及后肢肌肉，进行动物体内的病毒分离和RT-PCR鉴定，同时对各器官组织进行组织病理学观察。结果接种EV71后，颅内、肌内和腹腔注射组小鼠体重增长缓慢，4～5d出现后肢麻痹，7d左右死亡。RT—PCR和病毒分离表明颅内、肌内和腹腔注射组的肌肉分离到病毒，颅内注射组脊髓也分离到病毒，经RT—PCR鉴定为EV71感染。肌电图显示颅内、肌内和腹腔注射组的时限显著增加，波幅显著降低，判断小鼠后肢麻痹可能既有神经源性损害又有肌源性损害。组织病理学观察发现，颅内、肌内、腹腔注射组小脑浦肯野细胞及颗粒细胞减少，脊髓前角白质区神经纤维肿胀，后肢肌肉组织大片坏死溶解、炎性细胞浸润，肺组织明显充血，局部心肌细胞肿胀，部分肝组织内可见巨噬样细胞及淋巴样细胞浸润，部分肾皮质中肾小球萎缩、数目减少，而口服组无明显病理变化。结论EV71JN200804株通过颅内、肌内和腹腔注射三种途径均能感染并导致1日龄BALB／c小鼠后肢麻痹，此动物模型可用于EV71致病机制和特异性抗病毒药物的研究及疫苗的评价。
- 李鹏岳盈盈宋楠楠李志会孟红
- 关键词：肠道病毒属小鼠近交BALB动物
