烧伤与复合伤国家重点实验室开放基金(2006B-2)
- 作品数：7 被引量：15H指数：3
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- 相关机构：第三军医大学新桥医院解放军第201医院北京军区总医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备被引量：2
- 2008年
- 目的:在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法:应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因,将其克隆到表达载体pET-32a(+)上构建重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达,目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化,用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,采用Western blot对抗体进行鉴定,并用ELISA分析抗体活性。结果:成功构建了pET-32a(+)-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达,获得了纯化重组蛋白,重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生,并具有良好的免疫活性。结论:成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白,制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础。
- 孙守勋李强刘静李玲蒲晓允
- 关键词：原核表达多克隆抗体单个核细胞
- 重组腺病毒介导的sTLR2和sTLR4体外抗炎效应的实验研究被引量：1
- 2012年
- 目的观察重组腺病毒介导的sTLR2和sTLR4对炎症模型细胞因子表达水平的影响。方法将人单核细胞系THP-1细胞随机分为正常对照组、炎症对照组、重组腺病毒AdTLR2组、重组腺病毒AdTLR4组、重组腺病毒AdTLR2+AdTLR4组。AdTLR2和AdTLR4单独或者联合作用于各组细胞,通过RT-PCR方法检测TLR2和TLR4 mRNA表达,应用ELISA法对上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量进行检测,探讨AdTLR2和AdTLR4对LPS诱导的THP-1细胞上清细胞因子表达水平的影响。结果通过RT-PCR方法检测THP-1细胞转染AdTLR2+AdTLR4后,TLR2和TLR4能够获得高表达。AdTLR2和AdTLR4单独和联合作用于LPS所致炎症细胞后,细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量较炎症对照组显著降低,且联合作用较单独作用组进一步降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论重组腺病毒AdTLR2和AdTLR4能够降低LPS所致炎性细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,并且联合使用的抗炎效果优于AdTLR2或AdTLR4的单独作用。提示制备的重组腺病毒能够分泌sTLR2和sTLR4,能有效抑制炎性细胞的活化,减少细胞因子的释放,具有一定的抗炎作用。
- 刘静孟冬娅孙守勋蒲晓允
- 关键词：腺病毒细胞因子LPS
- 重组腺病毒介导的sTLR2对LPS致炎小鼠抗炎效应的实验研究被引量：6
- 2010年
- 目的:观察携带Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒介导的sTLR2在小鼠体内的抗炎作用,为急性炎症反应的防治提供新的思路和治疗策略。方法:建立亚致死剂量脂多糖(LPS)所致炎症小鼠模型。将BALB/c小鼠随机分为正常对照组、炎症对照组及重组腺病毒(Ad)TLR2实验组。AdTLR2于致炎前后,分别作用于小鼠,观察其对小鼠生存时间的影响,并应用ELISA对血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量进行检测,探讨AdTLR2对小鼠血清细胞因子水平变化的影响。结果:重组AdTLR2作用于炎症小鼠模型后,实验组小鼠的生存时间与炎症对照组比较相对延长,并且实验组中血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的水平均较炎症对照组显著降低(P<0.05)。结论:重组AdTLR2能够使LPS所致炎症小鼠模型的生存时间相对延长,并能够降低炎症小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,提示AdTLR2在活体内可以分泌sTLR2蛋白发挥免疫调节作用并能降低血清中炎性细胞因子的水平,具有一定的抗炎作用。
- 孙守勋李强石妍刘静蒲晓允
- 关键词：TOLL样受体2LPS腺病毒抗炎
- 人TLR2和TLR4胞外区cDNA的克隆
- 2008年
- 目的从脂多糖诱导的外周血单个核细胞克隆人Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)胞外区cDNA。方法用不同浓度脂多糖在不同时间刺激单个核细胞后提取总RNA,RT-PCR方法半定量测定TLR2和TLR4的表达,应用pUCm-T载体克隆胞外区cDNA,双酶切以及DNA测序进行鉴定。结果单个核细胞在四种浓度脂多糖刺激3h、6h和12h后,TLR2和TLR4表达并不相同。15μg/mL脂多糖作用6hTLR2表达最高,10μg/mL脂多糖作用3hTLR4表达最高。经RT-PCR扩增TLR2和TLR4胞外区cDNA分别为1700bp和1900bp,T载体克隆、酶切鉴定及测序分析后证实,目的片段与GenBank中序列一致。结论脂多糖的诱导对外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达有显著影响,并且成功克隆了胞外区cDNA。
- 孙守勋李强刘静白晓蒲晓允
- 关键词：LPS单个核细胞胞外区基因表达
- 1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定被引量：3
- 2009年
- 目的构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体。方法以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeI酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定。结果人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL。结论成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础。
- 刘静李强孙守勋李玲柴若楠蒲晓允
- 关键词：腺病毒载体胞外区
- 人Toll样受体2细胞外区基因重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的:克隆人Toll样受体2(TLR2)细胞外区基因,并构建含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-TLR2。方法:应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2细胞外区基因,克隆入pUCm-T载体并转化大肠埃希菌感受态DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序分析后,用KpnⅠ和HindⅢ双酶切,将目的片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,双酶切鉴定并测序验证。结果:RT-PCR扩增得到约1000bp的目的基因片段,TA克隆后测序鉴定与GenBank中的序列一致,经酶切连接成功地将目的基因插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中。结论:成功克隆了人TLR2细胞外区基因,并构建了含目的基因的重组腺病毒穿梭载体。
- 孙守勋李强石妍刘静蒲晓允
- 关键词：TOLL样受体2重组腺病毒穿梭质粒单个核细胞
- 人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定被引量：6
- 2009年
- 目的构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定。方法应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆入pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中。将构建正确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用PmeⅠ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒。将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒。观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒。结果RT-PCR扩增得到的目的基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒。结论成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础。
- 孙守勋李强刘静蒲晓允
- 关键词：TOLL样受体2腺病毒科同源重组
