国家自然科学基金(30901276)
- 作品数：5 被引量：10H指数：2
- 相关作者：马辉范小勇张建华陈凌郭盛更多>>
- 相关机构：复旦大学上海交通大学附属第六人民医院上海生物制品研究所更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 耻垢分枝杆菌黏膜接种对小鼠过敏性哮喘的免疫调节作用被引量：5
- 2011年
- 目的观察耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)对过敏性哮喘小鼠防御素β-2(Defb2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、IFN-γ、IL-4及过敏原特异性IgE、IgG1、IgG2a表达的影响,探讨Ms黏膜接种干预哮喘的免疫调节机制。方法 SPF级BALB/c小鼠随机分为哮喘组、干预组、对照组3组。以卵清蛋白(OVA)致敏,气道激发建立哮喘模型。OVA致敏前7 d鼻黏膜接种Ms进行干预。以Real-time荧光定量PCR法检测肺组织Defb2、MIP1、MIP2 mRNA的表达,ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)、纵膈淋巴结细胞培养上清中MIP1、MIP2、IFN-γ、IL-4的浓度,ELISA法检测血清总IgE以及OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a水平。结果 Ms干预可以显著增高哮喘小鼠Defb-2 mRNA的表达(31.21±1.56对0.78±0.11,P<0.01);Ms干预可使哮喘小鼠表达增高的MIP1 mRNA降低(9.80±1.56对2.44±0.96,P<0.05),但对MIP2 mRNA的影响不明显(P>0.05);Ms干预可使BALF和淋巴结培养上清中MIP1、MIP2降低,使BALF和淋巴结培养上清中IL-4降低(97.43±7.83对153.80±5.20,150.75±54.58对625.81±55.98,P均<0.01),使BALF中IFN-γ升高(78.92±11.41对44.88±3.26,P<0.01);Ms干预可以显著降低哮喘小鼠血清总IgE、OVA-IgE、OVA-IgG1,升高OVA-IgG2a,降低哮喘小鼠OVA特异性IgG1/IgG2a比值(1.09±0.03对1.42±0.04,P<0.01)。结论 Ms黏膜免疫可以通过促进Defb-2表达增强哮喘小鼠抗感染能力,通过降低巨噬细胞炎症蛋白表达、调节Th1/Th2平衡、抑制过敏原特异性IgE表达等途径干预哮喘,耻垢分枝杆菌有望继卡介苗之后成为哮喘预防的另一候选疫苗。
- 郭盛吴良霞范小勇郝春莉马辉陈凌张建华
- 关键词：哮喘耻垢分枝杆菌巨噬细胞炎症蛋白防御素
- 分枝杆菌同源可控表达系统的建立及其应用被引量：2
- 2009年
- 目的构建分枝杆菌可控表达载体，利用其过表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的免疫保护性抗原，亲和层析纯化后分析免疫原性。方法应用PCR扩增耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Ms）乙酰胺酶编码基因启动子（pACE），构建分枝杆菌可控表达载体pMF系列；克隆Mtb嵌合抗原编码基因并用乙酰胺进行诱导表达，以Ni^2＋亲和层析纯化重组蛋白；并用该重组嵌合抗原Ag856 A2对卡介苗（BCG）免疫的小鼠脾细胞进行体外刺激，以IFN-γ酶联免疫斑点技术（ELISPOT）分析其免疫原性。结果成功构建了分枝杆菌可控表达载体pMF系列，利用0．02％乙酰胺进行诱导可实现目标抗原在Ms中的高水平表达；同时利用引入的6×Ilis标签可方便实现重组抗原的一步纯化，且该同源表达重组抗原可诱导更高水平IFN-γ的分泌。结论以Ms乙酰胺酶编码基因启动子pACE为基础构建的分枝杆菌可控表达系统可实现Mtb抗原在Ms中的高水平表达与纯化，与大肠杆菌异源表达相比，该同源表达重组抗原具有更好的免疫原性。
- 范小勇马辉郭建朱召芹郭盛淇赵国屏
- 关键词：分枝杆菌启动子
- 小鼠白细胞介素17A的原核表达及对RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响被引量：3
- 2010年
- 目的 在大肠杆菌中高效表达与纯化小鼠白细胞介素17A（mIL-17A）,并研究其对巨噬细胞分泌炎症因子的影响.方法 以活化的脾细胞为模板,通过RT-PCR法扩增小鼠IL-17a基因的编码序列,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17a,并在大肠杆菌（E.coli）中诱导表达,经亲和层析获得纯化的mIL-17A蛋白.以mIL-17A蛋白刺激体外培养的鼠巨噬细胞RAW264.7,72 h后应用realtime PCR法分析IL-6、巨噬细胞炎症蛋白1（Ccl3）、巨噬细胞炎症蛋白2（Cxcl3）、β防御素2（defensinβ2）的mRNA表达量,并用ELISA法检测培养上清中Ccl3、Cxcl3、IFN-γ、IL-4及IL-6的蛋白质表达水平.结果 在E.coli中成功高效表达了有生物活性的IL-17A蛋白,可促进体外培养的RAW264.7细胞IL-6、Cxcl3、defensin β2 mRNA的表达,并能促进Ccl3、Cxcl3、IFN-γ、IL-4以及IL-6蛋白的表达.结论 成功表达并制备了具备生物学活性的mIL-17A,该蛋白具有刺激巨噬细胞表达趋化因子、防御素及细胞因子的能力.
- 郭盛范小勇郝春莉马辉陈凌张建华
- 关键词：巨噬细胞炎症蛋白抗感染免疫Β防御素
- 分枝杆菌膜锚定表达载体的构建与亚细胞定位分析
- 2011年
- 目的构建分枝杆菌膜锚定表达载体，并分析外源目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位。方法在分枝杆菌胞内表达载体pMFA42的基础上进行改造，人工合成结核分枝杆菌（Myco—bacteriumtuberculosis，Mtb）相对分子质量（Mr）为19×10^3的脂蛋白膜分泌信号序列，将其插入高效的突变型furA基因启动子（pfurAma）下游构建新型的分枝杆菌膜锚定表达载体pMFA42M。PCR扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因，亚克隆至上述两种载体中并电转化耻垢分枝杆菌（Mycobacte—riumsmegmatis，Ms），分别获得重组EGFP融合表达菌株和膜锚定表达菌株；接着将Mtb主要保护性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的编码基因亚克隆入膜锚定表达载体pMFA42M中构建Mtb抗原-EGFP融合表达菌株；通过Westernblot和流式细胞表面标记技术来分析目标抗原的表达水平及其亚细胞定位，并进一步通过荧光显微镜直接观察重组EGFP融合表达菌株在体外和感染巨噬细胞后的荧光强度。结果通过引入Mtb19×10^3脂蛋白膜分泌信号，在高效pfurAma启动子的驱动下，成功地构建了分枝杆菌膜锚定表达载体。利用EGFP作为标签抗原，通过Westernblot、荧光显微观察和流式细胞表面标记等技术均证实了外源目标抗原可在分枝杆菌中高水平表达并定位至细胞膜上。结论本研究为重组BCG和分枝杆菌膜蛋白功能研究提供了一种新型的膜锚定表达载体，所构建的EGFP重组表达菌株亦可作为一种模式示踪菌为细胞吞噬和动物免疫中的细菌定植和移位分析提供新思路。
- 王鑫范小勇马辉曲勍
- 关键词：分枝杆菌增强型绿色荧光蛋白亚细胞定位
- 内含子A提高分枝杆菌热休克蛋白65 DNA疫苗的免疫原性
- 2012年
- 目的探讨以内含子A增强外源抗原在真核细胞中的表达效率及其对DNA疫苗在小鼠中免疫原性的影响。方法以分枝杆菌热休克蛋白65（Hsp65）为模式抗原，将其分别克隆入含有内含子A和不含内含子A的真核表达载体pCMV4．0和pVAX1，将表达Hsp65的不同重组质粒瞬时转染人胚肾上皮细胞系293T并免疫接种BALB／c小鼠，应用ELISA分析其所诱导产生的抗原特异性抗体水平及亚类，并以酶联免疫斑点试验（ELISPOT）和胞内细胞因子染色技术（ICS）分析其诱导产生的细胞免疫应答反应。结果含有内含子A的重组表达质粒pCMV4．0hsp65较之不含内含子A的pVAX1hsp65在293T细胞中的抗原表达量更高，免疫小鼠6周后诱导产生的抗-Hsp65特异性总IgG抗体水平（3．76±0．23对3．15±0．22，P〈0．01）和IgG2a／IgG1比值（4．08±0．04对2．234-0．12，P〈0．01）也更高，差异有统计学意义；分泌γ-干扰素（IFN-γ）的CD4^＋T淋巴细胞频率[（2．0±0．058）％对（1．5±0．087）％，t=4．804，P〈0．01]和CD8^＋T淋巴细胞频率[（0．6±0．058）％对（1．0±0．115）％，t=3．098，P〈0．05]增加，差异有统计学意义，提示其诱导产生了增强的Thl型免疫应答。结论内含子A可增强分枝杆菌Hsp65在真核细胞中的表达效率并可提高DNA疫苗在小鼠中的免疫原性。
- 吴娟马辉范小勇曲勍罗玉萍Douglas B．Lowrie
- 关键词：内含子疫苗免疫热休克蛋白质类
