国家自然科学基金(81101667)
- 作品数：12 被引量：17H指数：2
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- 相关机构：江南大学江苏省原子医学研究所浙江大学医学院附属儿童医院更多>>
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- 转录因子GATA3mRNA5＇非翻译区内部核糖体进入位点的活性
- 2016年
- GATA3（GA—TA-binding protein-3）是锌指蛋白GATA家族成员之一，在细胞的增殖和分化中起着重要的作用，GATA3在细胞中的异常表达也是导致众多肿瘤形成的原因。通过对GATA3mRNA5’非翻译区（untranslatedregion，uTR）进行分析，发现其UTR长达557bp并且具有复杂的二级结构。将GATA3mRNA5’UTR克隆至双荧光素酶报告载体pRL—FL中，瞬时转染至细胞中然后对细胞进行无血清培养后，发现GATA3mRNA5’UTR介导的翻译明显升高。将GATA3mRNA5’UTR克隆至△pRL—FL载体上，瞬时转染细胞后检测萤火虫荧光素酶的表达，发现GATA3mRNA5’UTR不具有隐含启动子，进而确定GATA3mRNA5’UTR具有内部核糖体进入位点（intemal ribosome entry sites，mES）元件；进一步对GATA3mRNA5’UTR进行序列截短分析，发现GATA3mRNA5’UTRq△345～557bp区间可能是抑制IRES活性的调控元件，而95～344bp区间则是IRES元件的主要活性中心调控域，并且在不同的细胞系中GATA3IRES元件的活性存在显著的差异。该研究结果表明，GATA3mRNA的5’UTR可参与GA]队3的表达调控。
- 陶义芬马晶朱瑞宇段作营金坚李华钟
- 关键词：GATA3内部核糖体进入位点荧光素酶
- 双缺陷型毕赤酵母X33突变株的诱变育种被引量：5
- 2016年
- 为促进Pichia pastoris X33α-1,6-甘露糖转移酶(OCH1p)与α-1,3-甘露糖转移酶(ALG3p)双突变菌株(och1 alg3 m X33)作为蛋白质表达宿主菌的应用,为双突变菌株进一步糖基化的研究奠定基础。作者通过紫外诱变和常压室温等离子体(ARTP)诱变的方法来提高双突变菌株的生长速度以及适应能力。经过4轮筛选发现了生长速度提高15%、温度敏感性有所降低、细胞存活率有所提高的双突变菌株。
- 顾鹏飞李萌朱瑞宇金坚
- 关键词：糖基化诱变
- 雌激素受体2(ESR2) mRNA 5'非翻译区内部核糖体进入位点活性的鉴定与分析被引量：2
- 2018年
- 真核生物除了传统的帽依赖型翻译机制外,还存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的翻译机制。雌激素受体2(estrogen receptor 2,ESR2)是雌激素受体家族成员之一,其编码的蛋白质在许多肿瘤中发挥重要的作用。ESR2蛋白的异常表达会导致众多肿瘤的发生,但其蛋白质翻译水平的调控机制至今仍不清楚。研究发现,在药物刺激的条件下,乳腺癌细胞MCF7/WT中ESR2蛋白的表达提高,但是其转录水平基本未见发生改变。猜测ESR2 mRNA5'非翻译区(5'untranslated region,5'UTR)具有IRES活性。为了验证ESR2 mRNA 5'UTR是否具有IRES元件,将ESR2 mRNA 5'UTR插入到双顺反子报告基因载体(pRF)中,构建pRL-ESR2-FL重组质粒载体,将其瞬时转染到HEK293细胞。结果发现,ESR2 mRNA 5'UTR有假定的IRES活性。并且通过3个排除实验验证了ESR2 IRES活性与其5'UTR中的内部潜在启动子(P<0.0001)、内部剪切位点以及核糖体通读无关。进一步对其序列进行截短研究发现,ESR2 IRES活性发挥的关键区域是3'端的439~468 nt,且ESR2 IRES最大活性的发挥依赖于5'UTR序列的完整性。并且发现,ESR2 IRES活性的发挥不但需要特定的一级核酸序列,还要有稳定的二级茎环结构。此研究有望为ESR2蛋白调控的相关疾病提供新的药物治疗靶点。
- 孙柳柳黄方婷张旭燕朱瑞宇金坚
- 关键词：内部核糖体进入位点
- 内部核糖体进入位点(IRES)调控细胞血清饥饿应激条件下PRDM13的翻译
- 2016年
- PRDM13是锌指蛋白转录抑制因子（positive regulatory domain zinc finger protein,PRDM）家族中的一员,其在细胞分化、肿瘤的发生和恶性转化中起着重要的作用。而对于PRDM13基因侧翼序列是否含有内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）及其功能所知甚少。本研究对PRDM13 5＇端的非翻译区（5＇UTR）进行IRES结构与功能分析,探索其在细胞血清饥饿应激条件下对PRDM13翻译的影响。实验发现,在血清饥饿的条件下,肝癌细胞Bel7402/WT中PRDM13的蛋白质水平增加,但是其mRNA水平基本没有变化。将PRDM13 5＇UTR的序列插入双顺反子的报告载体（pRL-FL）中,并且将构建的载体（pRL-PRDM13-FL）转染进细胞中,结果显示,PRDM13 5＇UTR含有IRES,且发现PRDM13 5＇UTR中的105 nt（53~157）对其IRES的功能至关重要。在帽依赖的翻译（cap-dependent translation）机制被抑制时,IRES这种机制可有效维持PRDM13蛋白合成。本研究提供了在细胞压力条件下调节PRDM13蛋白合成的一种新的解释。
- 马文囡丁鹏鹏陶义芬陈蕴朱瑞宇金坚
- 关键词：内部核糖体进入位点翻译
- 人乳腺癌细胞及其耐药细胞转录因子表达的差异被引量：4
- 2012年
- 目的研究阿霉素在不同药敏性肿瘤细胞中转录因子水平的差异,为肿瘤细胞多药耐药机制的研究提供参考。方法通过细胞活力检测野生型乳腺癌细胞(MCF7/W)和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞(MCF7/ADM)的药敏性差异;荧光显微镜镜检阿霉素荧光分布;有机溶剂萃取法进行全细胞阿霉素吸收分析;细胞膜和核膜分离检测阿霉素的亚细胞定位;通过转录因子膜分析MCF7/W和MCF7/ADM细胞中转录因子表达差异。结果两株细胞的耐药IC50相差近10 000倍左右;利用镜检和定量分析,发现阿霉素在MCF7/W细胞中主要定位于胞核,而在MCF7/ADM细胞中则蓄积较少且主要定位于胞质;转录因子差异分析发现膜上总345个转录因子中,与野生型细胞相比,耐药细胞的106个转录因子表达上调,32个表达下调。结论阿霉素在耐药细胞与野生型细胞中转录因子表达的差异,可能是干扰阿霉素入核,阻止其功能发挥的基础。
- 陈淑娴朱瑞宇付强金坚
- 关键词：MCF-7/ADMIC50转录因子耐药细胞亚细胞定位
- 内部核糖体进入位点(IRES)调控多种癌细胞系中尾型同源盒转录因子2的翻译被引量：1
- 2017年
- 尾型同源盒转录因子2(caudal type homeobox transcription factor 2,CDX2)促进肠癌细胞增殖,并具有致瘤的潜能。然而,对于CDX2翻译水平的调控机制研究甚少。本研究基于转染及报告酶活性分析结果,首次证明CDX2 5'非翻译区(5'untranslated region,5'-UTR)存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),并通过IRES在HEK293细胞以及肝癌、肠癌和卵巢癌等肿瘤细胞株中介导翻译起始。IRES介导的翻译机制与经典的帽依赖翻译途径(cap-dependent translation)不同,在一些IRES反式作用因子(IRES trans-acting factors,ITAFs)的作用下,不需要帽状结构,IRES可以直接招募核糖体小亚基,起始翻译。同时,肿瘤细胞内IRES介导的翻译方式可能是引起蛋白质异常表达的原因之一。通过Western印迹检测CDX2在4种肿瘤细胞系中的表达,发现CDX2的IRES活性与其在肿瘤细胞中蛋白质表达量正相关,其活性在耐药型卵巢肿瘤细胞株中最高。此外,CDX2 IRES元件的5'端截短及报告酶活性分析证明,CDX2 5'-UTR的活性中心位于68~147碱基之间,而位于5'末端的67个碱基形成一个远端茎环,抑制全长IRES的活性。定点突变68~147活性区域的实验结果揭示,3个茎环结构域(68GCCGGC73,88GCCAG92和114CUCUG118)是IRES元件中不可或缺的部分。上述结果证明,CDX2 5'-UTR具有IRES活性,其活性依赖于二级茎环结构。因此,可以针对特殊的茎环结构域进行研究,使之成为肿瘤药物作用靶点。
- 高文青李琪陈蕴朱瑞宇金坚
- 关键词：内部核糖体进入位点
- 转录因子FOSB mRNA 5′非翻译区内部核糖体进入位点的活性被引量：1
- 2019年
- 研究FOSB基因侧翼序列是否含有内部核糖体进入位点(internal ribosme entry site,IRES),进而探究其生理功能。作者利用双顺反子报告载体(pRL-FL),构建检测质粒(pRL-FOSB-FL),并将其转染到人胚肾细胞HEK293和4种癌细胞中,检测FOSB mRNA 5′非翻译区(5′untranslated region,5′UTR)IRES活性并通过逐步截断探索其活性中心,最后对肝癌细胞Bel-7402进行药物(紫杉醇和顺铂)刺激。报告载体的结果显示,FOSB mRNA 5′UTR具有IRES活性,且在不同细胞中FOSB IRES活性存在显著性差异,在卵巢癌细胞A2780/WT细胞中FOSB IRES活性较高。序列截断发现,FOSB mRNA 5′UTR中的160nt(-376到-217)对其IRES的功能至关重要.在肝癌细胞中,随着加药浓度的增加,其IRES活性逐渐增加,尤其在紫杉醇刺激下活性增加更为明显。本研究发现的FOSB基因的这些特性为研究FOSB在肿瘤的预防与治疗提供了一种新的思路。
- 马晶孙柳柳马文囡陶义芬陈蕴朱瑞宇金坚
- 关键词：内部核糖体进入位点
- 下调TRPC5的表达对卵巢癌细胞耐药性影响的研究被引量：1
- 2019年
- 为探究瞬时受体通道5(transient receptor potential canonical 5, TRPC5)是否参与影响卵巢癌细胞对紫杉醇(paclitaxel, PTX)的耐药性,转染TPRC5-siRNA至A2780/PTX细胞。MTT检测A2780/WT、A2780/PTX和A2780/PTX细胞+siTRPC5对紫杉醇的敏感性;RT-PCR和Western blot检测TRPC5、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的mRNA和蛋白表达水平;细胞免疫荧光检测β-catenin、c-myc和Cyclin D1蛋白的表达水平。MTT、RT-PCR和Western blot结果显示, A2780/PTX细胞对PTX的敏感性(IC50=84.4μmol/L)低于A2780/WT细胞(IC50=1.98μmol/L), A2780/PTX细胞的TRPC5和P-gp的mRNA和蛋白表达水平显著高于A2780/WT细胞;用siTRPC5敲低A2780/PTX细胞TRPC5的表达水平,可显著减少其P-gp的表达量,降低A2780/PTX细胞对PTX的敏感性。细胞免疫荧光实验结果显示,降低A2780/PTX细胞TRPC5的表达水平,细胞核中β-catenin的表达量减少,且Cyclin D1和c-myc的表达量也明显降低。TRPC5参与影响卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药性,并且通过Wnt/β-catenin信号通路影响耐药蛋白P-gp的表达进而影响其耐药性。
- 傅倩云朱瑞宇方罗吴妙莲蔡志波金坚
- 关键词：P-糖蛋白卵巢癌紫杉醇耐药性WNT/Β-CATENIN通路
- 双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达被引量：1
- 2012年
- 目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。
- 高明珠朱瑞宇陈蕴金坚
- 关键词：启动子真核细胞基因表达
- α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)缺陷型突变株毕赤酵母X33生长条件优化
- 2013年
- 为促进Pichia pastoris X33α-1,6甘露糖转移酶(Och1p)突变株(och1 mX33)作为蛋白表达宿主菌的应用,提高Pichiapastoris X33突变株的生长速度,本研究对影响酵母生长条件中的接种量、通气量、培养基pH值、碳源含量(甘油含量)、外界渗透压(培养基中加入山梨醇)及培养温度各因素进行研究,发现pH 5.0、培养基中添加0.5 mol/L山梨醇的单因素条件可提高Pichia pastoris X33突变菌株的生长速度,提高Pichia pastoris X33突变株作为宿主菌应用的可行性。
- 李萌朱一菲张大成朱瑞宇金坚
- 关键词：糖基化
