甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2009-10)
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 相关作者：白伟杰卢曾军孙普刘在新李冬更多>>
- 相关机构：中国农业科学院兰州兽医研究所更多>>
- 发文基金：甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 通过基因组合成构建美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆被引量：1
- 2017年
- 根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GSWW分离株的全长基因组序列信息,采用合成生物学的方法,将全长基因组序列分为两段(7 636 bp和7 774 bp)分别连接到低拷贝载体p BR-322载体中,然后将2个半长片段相连接得到全长c DNA克隆。将质粒线性化后,体外转录获得全长RNA,经电穿孔转染BHK21细胞拯救获得了初代病毒。将初代病毒接种感染Marc-145细胞进行传代,接毒后第36小时即可观察到完全的致细胞病变效应(CPE)。通过RT-PCR、间接免疫荧光、测序验证,证明成功获得了PRRSV GSWW株的感染性克隆。通过实时荧光定量法检测拯救病毒与原田间分离毒的复制能力,没有显著差异,采用实时荧光定量法测得的拯救病毒复制的最高效价为1×1010copies/m L。本研究表明,采用长片段基因合成的方法进行PRRSV感染性克隆的构建,方法可行且速度快,为PRRSV流行毒感染致病机理、免疫机制和基于反向遗传学的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。
- 王治家张婧白伟杰孙普曹轶梅李冬刘在新卢曾军
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因合成感染性克隆
- 基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立被引量：1
- 2012年
- 目的建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30份临床疑似病料进行检测,并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较。结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的最佳探针浓度为0.4μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝/μL。检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100%,与普通PCR的检测结果(25/30)比较,本方法对临床样品的检出率(28/30)更高。结论建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测。
- 祝秀梅马全英杜平王凡吕志慧牟克斌
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因
- 表达FMDVB7多表位基因的重组PRRSV的拯救与复制水平的测定
- 2016年
- 利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白（EGFP）基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV（v Fl12-EGFP）。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP基因正确表达。随后,采用相同的策略构建了表达口蹄疫病毒（FMDV）B7多表位基因的重组PRRSV（v Fl12-B7）,拯救病毒v Fl12-B7感染Marc-145细胞后,可观察到典型的CPE;对拯救病毒进行RT-PCR扩增和序列测定,表明多表位基因正确插入;荧光定量PCR检测,第1代和第4代拯救病毒的拷贝数分别为3.76×10^5 copies/L与1.58×10^8 copies/L,说明重组病毒具有较好的复制能力,为以PRRSV为载体表达口蹄疫多表位基因活载体疫苗研究奠定了基础。
- 白伟杰曹轶梅包慧芳孙普付元芳李平花白兴文陈应理李坤马雪青刘在新李冬卢曾军
- 关键词：PRRSV感染性克隆FMDVB细胞表位
