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国家自然科学基金(30240022): 作品数：21 被引量：62H指数：4; 相关作者：邹萍张敏游泳刘芳何伟更多>>; 相关机构：华中科技大学三峡大学第一临床医学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金湖北省自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

调控CD_(95)的锤头状核酶抑制小鼠T细胞凋亡及杀伤活性的作用研究: 2005年; 张敏游泳童允洁陈智超刘陵波邹萍; 关键词：T细胞凋亡杀伤活性移植物抗白血病小鼠 GVL效应

抗Fas锤头状核酶增强小鼠T细胞杀伤粒-单核白血病细胞的研究: 2007年; 目的研究抗Fas锤头状核酶对T细胞Fas表达及其凋亡的影响,探讨增强供者淋巴细胞输注时移植物抗白血病(graft versus leukemia,GVL)效应的新策略。方法构建可有效切割Fas mRNA的锤头状核酶真核质粒,电穿孔法将其导入小鼠细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)细胞株CTLL-2中,借助RT-PCR和Western blot检测细胞Fas的表达,同时检测转染前后细胞Caspase-3活性的改变和细胞凋亡(AnnexinⅤ-FITC法)。MTT法检测空白对照组、转染空载体组及转染pU6-RZ596组CTLL-2细胞的增殖情况和体外杀伤粒-单核白血病细胞(WEHI-3)的活性。结果构建的U6嵌合型锤头状核酶RZ596在细胞内能有效切割Fas,RT-PCR电泳检测其与β-actin条带的灰度比值:CTLL-2细胞空白对照组为(1.06±0.12),转染空载体组为(0.98±0.15),转染pU6-RZ596组为(0.43±0.11)(n=3);Fas蛋白的Western blot检测显示:以空白对照组灰度值为1,转染空载体组和转染pU6-RZ596组电泳条带的灰度比值分别为(0.98±0.13)和(0.45±0.08)(n=3),提示抗Fas锤头状核酶可明显降低小鼠活化CTLL-2的Fas水平。与高表达Fas配体(FasL)的WEHI-3细胞共孵育,CTLL-2细胞的存活率和体外杀伤活性明显增加,空白对照组、转染空载体组和转染pU6-RZ596组的细胞凋亡率分别为88%、84%和37%,对WEHI-3细胞杀伤活性分别为32%、31%和67%。结论抗Fas锤头状核酶能显著降低小鼠活化CTLL-2细胞的Fas表达,使其免于Fas途径的凋亡。; 黎纬明刘凌波邹萍何伟张敏; 关键词：细胞毒T淋巴细胞

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达: 2005年; 目的:构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中呈分泌型表达,为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。方法:采用多聚酶链反应(PCR)技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA(cDNA)的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中,获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG;采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株;免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。结果:DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点,CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达,其分子量大小和预期的基本一致,该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。结论:成功构建pcDNA/CD80-IgG真核表达载体,并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。; 何伟邹萍张敏; 关键词：免疫逃逸中国仓鼠卵巢细胞

PPAR-γ在肺癌中的表达及在肺癌凋亡中的作用研究被引量：20: 2006年; 背景与目的过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR-γ)是对机体代谢过程起重要调节作用的一种核激素受体。研究表明肿瘤(包括肺癌)组织及细胞可表达PPAR-γ,且经其配体活化后可影响肿瘤细胞的分化、增殖及凋亡。本研究的目的是分析PPAR-γ的表达与肺癌临床病理特征之间的关系,并探讨PPAR-γ的配体对肺癌细胞生长的影响及其诱导凋亡的机制。方法采用免疫组化法检测15例非癌肺组织和64例肺癌组织中PPAR-γ的表达,并通过图像分析测定各组的平均吸光度值。采用RT-PCR和Western blot检测肺癌细胞株中PPAR-γ的表达。细胞经PPAR-γ的配体处理后,采用TUNEL法检测凋亡,并用caspase-3活性检测试剂盒检测其活性变化。结果PPAR-γ在肺癌组织中的表达显著高于非癌肺组织。PPAR-γ的表达与肿瘤病理类型、细胞分化程度、术后TNM分期有密切关系。肺癌细胞株中有PPAR-γ的表达,且经其配体活化后,caspase-3的活性明显增加,并能诱导细胞凋亡。结论PPAR-γ表达与肺癌的临床病理特征密切相关。活化后的PPAR-γ可使肺癌细胞caspase-3的活性增强,从而使细胞更易发生凋亡。PPAR-γ有可能成为未来肺癌诊断和治疗的一个新靶点。; 何晓燕张敏陈智超游泳田蕾邹萍; 关键词：PPAR-Γ 肺肿瘤临床病理凋亡

抗Fas锤头状核酶阻抑小鼠急性粒-单核白血病细胞免疫逃逸的研究(英文): 2006年; 为了研究抗Fas锤头状核酶对T细胞Fas表达及其凋亡的影响和探讨增强供者淋巴细胞输注时移植物抗白血病(GVL)效应的新策略,构建可有效切割FasmRNA的锤头状核酶真核质粒,用电穿孔法将其导入小鼠CTL细胞株CTLL-2之后,借助RT-PCR和Westernblot检测其Fas的表达,同时检测转染前后其胱冬酶-3(Caspase-3)活性和凋亡(AnnexinV-FITC法)的改变,并用MTT法检测空白对照组、空载体转染组及pU6-RZ596转染组CTLL-2细胞的增殖情况和体外杀伤小鼠急性粒-单核白血病细胞(WEHI-3)的活性。结果表明:构建的U6嵌合型锤头状核酶RZ596在细胞内能有效切割Fas,明显降低小鼠活化CTLL-2的Fas水平,与高表达Fas配体的WEHI-3孵育后,其存活率和体外杀伤WEHI-3活性明显高于对照组。结论:抗Fas核酶能显著降低小鼠活化CTLL-2的Fas表达,使其免于WEHI-3的膜Fas配体经Fas途径所致的凋亡,并提高CTL对小鼠急性粒-单核白血病细胞的杀伤力,从而阻抑小鼠急性粒-单核白血病细胞的免疫逃逸。; 刘凌波黎纬明邹萍何伟张敏; 关键词：急性粒-单核细胞白血病免疫逃逸

CD80-IgG融合蛋白的表达、纯化与鉴定: 2005年; 目的构建CD80IgG融合基因表达载体,表达并纯化该融合蛋白,初步探讨其增强抗肿瘤免疫的作用方法将小鼠CD80分子胞外段和IgGFc段cDNA串联起来,定向克隆入质粒pcDNA3.0中,使其在哺乳动物细胞中表达。采用免疫亲和层析法纯化,免疫印迹和斑点ELISA鉴定表达的融合蛋白,流式细胞术、MTT法检测其增强白血病细胞CD80分子表达及促进T细胞增殖的功能。结果DNA测序证明两段基因正确插入质粒载体;亲和层析纯化得到浓度为0.1mg/ml,纯度为95%的蛋白质溶液;免疫印迹、ELISA表明该蛋白质即为CD80IgG融合蛋白流式细胞术证明其能够提高白血病细胞表面CD80分子的表达。结论成功构建融合基因表达载体,表达并纯化出融合蛋白,该蛋白可增强CD80分子的表达。; 何伟刘芳冯献启张敏刘凌波邹萍; 关键词：融合基因

Initial Study on Immune Escape Mechanism of Mouse Acute Myelomonocytic Leukemic Cell Line WEHI-3: 2006年; 客观：调查船边交货，船边交货 ligand (FasL ) 和 CD80on 的表示老鼠的房间表面尖锐 myelomonocytic 白血病房间线 WEHI-3 和功能 ofFasL。方法：船边交货， FasL 和 CD80 的表示被 flowcytometry 在 WEHI-3 房间表面上检测。同时， FasL 的功能被胸腺嘧啶核甙(~ 3H-TdR ) 决定 Incorporation.Results：WEHI-3 房间表面上的 CD80 和船边交货的表示分别地是 5.06%± 0 .41% 和 6.75%± 2 .31%(n=5 ) ，并且 FasL 的表示直到 63.73%± 5 .23%(n=5 ) 。apoptotic 率 ofYAC-1 房间当时，分别地是 26%± 4 .5% ， 35%± 3 .2% 和 43%± 2 .7%(n=5 ) WEHI-3 (受动器房间， E ) 并且 Fas^+ YAC-1 房间(目标房间， T ) 在 3:1， 10:1 和 30:1 .Conclusion 的比率是有教养的：WEHI-3 房间表示高 FasL，低船边交货和 CD80，并且能导致 Fas^+YAC-1 房间的 apoptosis。; 黎纬明刘凌波何伟邹萍; 关键词：免疫逃逸机制急性白血病病理机制

抗Fas核酶抑制小鼠T细胞凋亡被引量：2: 2005年; 目的　研究抗Fas核酶对小鼠原代T细胞凋亡的抑制作用, 探索增强T细胞抗凋亡能力的新途径。方法设计并合成针对小鼠Fas基因的锤头状核酶, 通过电穿孔转染法将其导入小鼠脾脏T细胞, 通过RT -PCR、Westernblot检测细胞上Fas的表达, 细胞经抗Fas的抗体(JO2 ) 作用后, 通过Caspase -3 活性检测试剂盒测转染前后细胞Caspase 3活性的变化, MTT法测细胞的增殖, Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒测细胞凋亡。结果　①与对照组、空载体和突变核酶转染组相比, 细胞表面的Fas水平明显降低; ②与抗Fas的抗体孵育后, 与转染空载体和突变核酶的细胞相比, 转染核酶的细胞Caspase- 3活性明显降低; ③经抗Fas抗体处理后, 细胞的增殖活性明显增高; ④与空载体和突变核酶转染组相比, 转染核酶的细胞凋亡率明显降低。结论　小鼠活化T细胞上高表达Fas, 抗Fas核酶能显著降低其Fas水平, 使细胞免于Fas途径的凋亡, 从而增强其抗凋亡能力。; 张敏陈智超刘仲萍游泳王海燕仲照东邹萍; 关键词：核酶 T淋巴细胞细胞凋亡 FAS 肿瘤免疫

Chk1基因沉默增强K562/A02细胞对阿霉素敏感性的实验研究被引量：1: 2006年; 目的研究Chk1基因沉默对人红白血病耐药细胞株K562/A02(耐阿霉素)生长的影响,探讨Chk1在白血病细胞耐药中的作用。方法通过电穿孔转染法将特异性靶向Chk1的短发卡状RNA(shRNA)导入K562/A02细胞,应用RT-PCR、Weston-blot检测细胞内Chk1的表达,经阿霉素作用后,流式细胞术(FCM)检测其细胞周期分布及细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖。结果与对照组和空载体转染组相比,shRNA使细胞中Chk1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%。抑制Chk1的表达可解除阿霉素引起的G2/M期阻滞;使阿霉素诱导的细胞凋亡率由转染前的(5.67±0.78)%上升到(19.25±1.41)%;在阿霉素浓度为0.4 mg/L、4 mg/L时,细胞的增殖活性分别下降12%、20%。结论靶向Chk1 shRNA有效地抑制了Chk1的表达,阻断了细胞周期检测点信号传导通路,从而增强了K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,有可能为临床上克服白血病的化疗耐药提供新的作用靶点及治疗途径。; 王海燕邹萍张敏游泳刘芳; 关键词：K562/A02细胞 RNA干扰白血病细胞耐药

PLK1基因沉默抑制HeLa细胞凋亡被引量：9: 2006年; 以高表达Polo样激酶1(Polo-likekinase1,PLK1)的宫颈癌细胞系HeLa细胞为模型,观察针对PLK1基因的短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)对其凋亡和增殖的影响.设计并合成了针对PLK1的shRNA,将其导入构建的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的RNAi(RNAinterference)表达载体中.通过RT-PCR和Western印迹分别检测HeLa细胞PLK1基因和蛋白水平的表达,以流式细胞仪和PI-Hochest双染法测细胞凋亡,MTT法检测细胞的增殖水平.成功构建了携带EGFP的RNAi表达载体pEGFP-H1.转染shRNA后,HeLa细胞PLK1的表达降低至30%.与对照组和空载体转染组相比,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,其增殖活性则明显降低.本课题构建的RNAi表达载体便于观察靶基因的转染情况,且不影响H1启动子的体内转录.PLK1的基因沉默能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,有可能为未来肿瘤的治疗找到新的靶点和有效途径.; 张敏游泳陈智超肖娟刘芳仲照东田蕾邹萍; 关键词：POLO样激酶1 真核表达载体 HELA细胞凋亡

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