江苏省自然科学基金(BK2011536)
- 作品数：13 被引量：19H指数：3
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- 相关机构：江苏农牧科技职业学院扬州大学甘肃农业大学更多>>
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- 牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达与鉴定被引量：4
- 2011年
- 为了在毕赤酵母中获得牛气管抗菌肽(bTAP)的表达,根据已发表的牛气管抗菌肽序列和毕赤酵母对密码子的偏爱性设计2对引物,采用重叠延伸PCR法获得bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母(Pichia pastoris)pPIC9K质粒连接,构建表达载体pPIC9K-bTAP。用SalⅠ酶切线性化pPIC9K-bTAP质粒后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导其表达。SDS-PAGE分析结果表明表达的重组蛋白质分子量正确,抑菌试验结果表明表达的重组蛋白质bTAP对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。
- 王安平李哲峰朱善元王永娟吴双黄文强左伟勇洪伟鸣孙怀昌
- 关键词：毕赤酵母抗菌活性
- 禽腺联病毒VP3基因的原核表达及多抗的制备
- 2013年
- 根据已发表的禽腺联病毒(AAAV)基因组序列设计了1对引物,经PCR扩增出VP3基因,将其克隆入原核表达载体pET-30a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下VP3蛋白获得了正确表达,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白的分子质量正确。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白VP3的多抗血清,Western-blot结果显示,制备的抗血清能够与AAAV VP抗原发生特异反应。结果表明,VP3基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP基因的表达检测。
- 王安平朱善元王永娟吴双左伟勇洪伟鸣
- 关键词：VP基因原核表达
- 禽腺联病毒Rep78、Rep52基因的原核表达及多抗制备被引量：1
- 2013年
- 为制备禽腺联病毒Rep蛋白多抗血清,根据已发表的禽腺联病毒基因组序列设计2对引物,扩增出Rep78、Rep52基因,分别将其克隆入原核表达载体pET-30a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,2种蛋白均获得了高效表达,SDS-PAGE显示2种重组蛋白分子量均正确。将重组蛋白切胶免疫ICR小鼠,分别制备了针对2种蛋白的多抗血清,Western blot实验显示制备的抗血清能够与Rep78和Rep52抗原发生特异反应。以上结果说明,Rep78和Rep52蛋白在大肠杆菌中获得成功表达,且制备的多抗血清可用于Rep基因的表达检测。
- 朱善元王安平吴双王永娟左伟勇洪伟鸣
- 关键词：原核表达抗血清
- 鸭肝炎病毒Ⅰ型VP35'端截短基因的原核表达
- 2014年
- 鸭病毒性肝炎（ Duck viral hepatitit,DVH）是一种由鸭肝炎病毒（ Duck hepatitis virus,DHV）感染导致的急性和高度致死性传染病,可引起21日龄以下的雏鸭发生急性肝炎,有的可能腹泻,病死率高达100%,是严重危害养鸭业的疫病之一。 DHV 主要包括3个血清型,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。3个血清型有明显的差异,无交叉免疫性。目前中国发生和流行的主要是Ⅰ型鸭肝炎病毒（ DHV-Ⅰ）[1]。该病毒属于小 RNA病毒科,为无囊膜的单股正链RNA病毒[2-3],其基因组大小约为7690 nt,具有1个开放阅读框,编码2249个氨基酸的聚合蛋白质。该聚合蛋白质经蛋白酶水解可产生11种蛋白质,即 VP0、VP1、VP3、2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D[4]；其中 VP3蛋白质位于衣壳表面,是 DHV 重要的结构蛋白质之一。DHV-1和人肠道病毒（ Human parechovirus,HPeV）同属于小RNA病毒科,其中HPeV VP3蛋白质的N-末端约20个氨基酸的区域具有很强的免疫原性[5],有文献报道 DHV-ⅠVP3蛋白质在该区域有较高的表面可及性、亲水性值和抗原指数,同样具有较强的免疫原性[6]。
- 张继玲朱善元王安平刘俊王岑左为勇洪伟明
- 关键词：VP3基因原核表达DUCKHEPATITISVIRUS
- 内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达被引量：3
- 2014年
- 将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。
- 王安平朱善元吴双王永娟左伟勇洪伟鸣
- 关键词：人溶菌酶毕赤酵母内含肽弹性蛋白
- 1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备被引量：1
- 2015年
- 根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。
- 王安平朱善元吴双
- 关键词：3D基因原核表达抗血清
- 单增李斯特菌Hly基因的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：4
- 2017年
- 为获得单增李斯特菌溶血素(Listeriolysiono,LLO)蛋白及其多克隆抗体。根据单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列设计了一对特异性引物,扩增出Hly基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,并转化于大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的作用下重组LLO蛋白成功表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量约为69.3 ku,且主要以包涵体形式表达LLO蛋白。将重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗LLO抗体。Western-blot检测到一条约69.3 ku的特异性条带,表明该抗体具有较强的特异性。单增李斯特菌溶血素基因Hly在大肠杆菌中已成功表达,且制备的多克隆抗体可用于LLO蛋白的检测。
- 洪伟鸣宋亮左伟勇
- 关键词：单增李斯特菌原核表达多克隆抗体
- 禽腺联病毒VP基因在昆虫细胞中的表达
- 2014年
- 为同时在昆虫细胞中按照合适比例表达禽腺联病毒的3个结构蛋白质,首先根据禽腺联病毒VP基因序列设计引物,扩增VP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转移载体pFastBac-VP,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP。SDS-PAGE结果分析表明,3个结构蛋白质VP1、VP2和VP3均获得了表达,分子量正确,且比例为1∶1∶10。Western blot结果显示,表达的重组蛋白质能够与VP3多抗反应。以上结果说明禽腺联病毒的3个结构蛋白质均在昆虫细胞中获得了成功表达。
- 王安平朱善元吴双王永娟左伟勇洪伟鸣
- 关键词：VP基因昆虫细胞
- 禽腺联病毒Rep基因在昆虫细胞中的表达
- 2014年
- 根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了成功表达。
- 朱善元王安平吴双王永娟左伟勇洪伟鸣
- 关键词：昆虫细胞
- 毕赤酵母表达人溶菌酶基因的初步研究被引量：3
- 2013年
- 为在毕赤酵母中表达人溶菌酶基因,根据已发表的人溶菌酶基因序列设计引物,扩增人溶菌酶全基因片段,将其克隆进巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-LYZ,经Sac I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达。SDS-PAGE证实表达的重组蛋白质分子量正确,抑菌试验结果表明重组hLYZ对微球菌具有良好的抑菌效果。说明人溶菌酶基因在毕赤酵母中成功表达。
- 王安平朱善元王永娟吴双左伟勇洪伟鸣
- 关键词：人溶菌酶毕赤酵母抑菌活性
