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Rab7真核表达载体的构建及其在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中的表达被引量：1: 2012年; 目的构建Rab7的真核表达载体,研究其在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达。方法 RT-PCR方法分析Rab7在组织和细胞中的表达。以RAW264.7细胞的cDNA为模板,根据GenBank公布的小鼠Rab7全长序列设计引物,扩增Rab7基因的开放阅读框。将其与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,构建pcDNA-Rab7重组质粒。用脂质体将Rab7真核表达载体瞬时转染RAW264.7细胞,RT-PCR和Western blot法鉴定Rab7的过表达。结果 Rab7重组载体测序结果与GenBank中报道的Rab7序列的同源性为100%。RT-PCR和Western blot结果显示Rab7真核表达载体瞬时转染RAW264.7细胞后,Rab7表达显著增高。结论成功构建了Rab7真核表达载体。为今后研究Rab7在巨噬细胞中的功能奠定了基础。; 蔡富娟谢基明康鸿斌孙晓琳王娜李云旭王玉珍; 关键词：巨噬细胞真核表达载体过表达

Rab5a的组织表达分析及其真核表达载体的构建: 2013年; 目的:观察小鼠各脏器中Rab5a表达情况,并构建Rab5a真核表达载体并验证其表达情况。方法:采用RT-PCR和Real-time PCR方法检测Rab5a在小鼠组织中的表达。以小鼠巨噬细胞RAW264.7的cDNA为模板,根据GenBank中公布的小鼠Rab5a全长序列设计引物,扩增Rab5a的开放阅读框。将目的基因与真核表达载体pcDNA3.1/Flag(-)B连接,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,酶切鉴定后测序。将Rab5a真核表达载体转染RAW264.7细胞,RT-PCR及Real time PCR检测Rab5a表达水平。结果:在小鼠的心、肝、肺、肾、脾、睾丸、小肠和结肠中均有Rab5a表达,在脾和小肠中的表达量最高。Rab5a真核表达载体测序的结果显示与GenBank中报道的序列的同源性为100%。用Rab5a真核表达载体转染RAW264.7后Rab5a的表达量显著高于对照质粒转染细胞。结论:Rab5a广泛表达于小鼠各组织。我们成功构建了Rab5a真核表达载体,并在RAW264.7中成功表达。; 王娜谢基明孙晓琳宋亮王玉珍; 关键词：RAB5A 真核表达载体转染

Rab7 GTPase负向调节巨噬细胞中poly I:C诱导的细胞因子的表达被引量：2: 2011年; 目的:通过构建Rab7的失活突变载体tRab7(Rab7T22N),研究Rab7失活突变后对poly I:C诱导的RAW264.7巨噬细胞中细胞因子的影响。方法:利用PCR定点突变法构建Rab7的失活突变载体Rab7T22N,将Rab7的真核表达载体及其突变体tRab7通过脂质体法瞬时转染RAW264.7细胞,通过Western blot方法检测Rab7的表达情况。poly I:C刺激转染细胞不同时间后检测细胞因子IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达变化。结果:Western blot检测结果显示,与转染空质粒的对照细胞相比,转染Rab7和tRab7的细胞中Rab7的蛋白水平显著增高。Rab7过表达后,抑制了巨噬细胞RAW264.7中poly I:C刺激后IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的产生,而Rab7失活突变体tRab7(Rab7T22N)过表达后显著促进了IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达。结论:Rab7抑制了poly I:C刺激的巨噬细胞中IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达,该抑制作用依赖于其GTP结合活性。本研究为进一步阐明Rab7在TLR3信号转导通路中的作用奠定了基础。; 王玉珍谢基明王宁飞刘帅; 关键词：IFN-Β TNF-Α

地塞米松对大鼠急性肝损伤的治疗作用及机制探讨被引量：4: 2012年; 目的:探讨地塞米松(dexamethasone,Dex)对脂多糖(LPS)联合D-半乳糖胺(D-GalN)诱导的大鼠急性肝损伤的治疗作用及部分机制探讨。方法:(1)随机将大鼠分为正常对照组、模型组、治疗组。Dex(10mg/kg)、LPS(50g/kg)和D-GalN(300mg/kg)进行腹腔注射,16h后观察血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及肝脏组织中肿瘤坏死因子-а(TNF-а)的含量,观察肝组织病理学变化;(2)随机将大鼠分为生理盐水组和地塞米松组,处理后观察10d内大鼠的存活率,制作生存曲线。结果:模型组ALT、AST、TNF-а表达水平较对照组明显升高,治疗组水平较生理盐水组有明显的降低,与对照组水平相近;地塞米松组大鼠的死亡率较生理盐水组显著降低。结论:地塞米松通过降低TNF-а的表达保护对LPS/D-GalN诱导的大鼠内毒素性肝损伤。; 李云旭王玉珍王金玲谢基明康鸿斌刘亚鹏; 关键词：地塞米松内毒素肝损伤

Rab7负向调控巨噬细胞中CpG诱导的细胞因子的表达被引量：3: 2012年; 目的:研究Rab7过表达及失活突变(Rab7T22N)对CpG刺激的RAW264.7巨噬细胞中分泌细胞因子的影响。方法:采用RT-PCR和Real-time PCR检测RAW264.7细胞中Rab7在CpG刺激下表达模式。将Rab7真核表达质粒及失活突变质粒Rab7T22N通过脂质体法转染RAW264.7细胞,G418稳定筛选,Western法鉴定表达效果。用CpG刺激稳定表达Rab7的RAW264.7细胞系,RT-PCR和Real-time PCR检测细胞因子IL-6、IL-1β、IFN-β的表达量变化。结果:CpG刺激RAW264.7后,Rab7 mRNA表达水平逐渐增高,在8小时达到高峰,表达增高近4倍。Rab7过表达后,CpG刺激后产生的IL-6、IL-1β、IFN-β显著降低。巨噬细胞中Rab7失活突变后,在CpG刺激后IL-6、IL-1β、IFN-β的表达又显著增加。结论:CpG促进RAW264.7巨噬细胞中Rab7 mRNA的表达,Rab7抑制了CpG刺激的巨噬细胞中IL-6、IL-1β、IFN-β的表达,该抑制作用的发挥与其酶活性的GTP结合有关。该研究为进一步阐明Rab7在CpG/TLR9信号通路中的作用奠定了基础。; 王娜王玉珍万永青谢基明康鸿斌刘春霞; 关键词：CPG RAW264.7细胞

Rab7基因沉默对LPS活化的巨噬细胞中NO/iNOS的影响被引量：1: 2011年; 目的:研究Rab7基因沉默后对LPS刺激的巨噬细胞系RAW264.7表达NO/iNOS的影响。方法:设计并化学合成三对靶向于Rab7基因的干扰RNA:siRNA1、siRNA2、siRNA3。应用脂质体法将siRNA瞬时转染RAW264.7细胞,通过Real-time PCR和Western blot方法检测转染后Rab7的沉默效果。通过MTT法分析瞬时转染siRNA后RAW264.7细胞的生长特性。以LPS刺激Rab7基因沉默后的RAW264.7不同时间,检测NO和iNOS的表达量变化。结果:与对照相比,转染Rab7干扰序列siRNA3后,Rab7蛋白水平表达最低,Real-time PCR的结果显示,Rab7的mRNA水平降低50%(P<0.05)。Rab7基因沉默后48小时显著促进了巨噬细胞RAW264.7的生长(P<0.01)。Rab7干扰后,LPS刺激RAW264.7细胞12小时NO的表达显著增高(P<0.05)。RT-PCR的结果和Real-time PCR的结果证实,Rab7干扰后iNOS基因mRNA的表达显著高于对照(P<0.01)。结论:巨噬细胞RAW264.7中转染siRNA3沉默Rab7基因的效果最好。Rab7沉默后促进了LPS活化的巨噬细胞中NO和iNOS的表达。该研究为进一步阐明Rab7在TLRs信号通路中的作用奠定了基础。; 刘帅谢基明王玉珍宋亮王娜李云旭孙晓琳; 关键词：脂多糖 SIRNA 诱导型一氧化氮合成酶一氧化氮

过表达Rab7基因对LPS和Poly I:C活化的巨噬细胞RAW264.7中iNOS/NO的影响被引量：2: 2011年; 目的:通过建立稳定表达Rab7及其突变体的巨噬细胞系,分析稳定表达细胞系的生物学特性,研究Rab7及其突变体基因过表达后对LPS和Poly I:C刺激的巨噬细胞表达iNOS/NO的影响。方法:将Rab7及其突变体Rab7(T22N)的真核表达载体通过脂质体法转染RAW264.7细胞,G418选择性培养基筛选,建立稳定表达Rab7及Rab7T22N的细胞系。通过RT-PCR和Western blot方法鉴定稳定表达细胞系。通过观察细胞形态及MTT法分析稳定表达细胞系的生长特性。以LPS和PolyI:C刺激稳定表达细胞系,不同时间后检测NO和iNOS的表达量变化。结果:与转染空质粒的细胞相比,转染Rab7和Rab7T22N的细胞中Rab7的mRNA和蛋白水平都显著增高。Rab7过表达后引起细胞形态变化并显著抑制了细胞增殖,Rab7T22N过表达后促进细胞增殖。Rab7过表达后,巨噬细胞在LPS和Poly I:C刺激后分泌的iNOS和NO显著降低,而Rab7T22N过表达后iNOS和NO的分泌又恢复。结论:成功建立了稳定表达Rab7及其突变体的细胞系。Rab7过表达后抑制了细胞增殖,抑制了Poly I:C和LPS刺激后巨噬细胞中NO和iNOS的表达。该研究为进一步阐明Rab7在TLRs信号通路中的作用奠定了基础。; 王宁飞蔡富娟刘帅宋亮谢业功王玉珍; 关键词：脂多糖一氧化氮合酶一氧化氮

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国家自然科学基金(30801001)

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