国家自然科学基金(39900180)
- 作品数：21 被引量：43H指数：5
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- 人p53四价功能域对提高抗体功能性亲和力的作用被引量：8
- 2005年
- 目的探讨人p53四价功能域在提高抗体功能性亲和力和生物学活性方面的的作用。方法利用基因克隆技术,将人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因与前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体基因融合,构建多价抗体(mBsAb),测序正确后,将其亚克隆入真核表达载体进行表达,纯化表达产物,并利用流式细胞仪及51Cr释放试验进行生物学活性测定。结果经酶切、测序分析证实mBsAb构建成功,其真核表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子量为67 000,mBsAb与PBMC和PC 3细胞的阳性结合率分别为70. 4%和81%,明显高于BsAb组。51Cr释放试验结果显示, mBsAb激活的T细胞可以裂解PC 3细胞,裂解百分率明显高于IL 2组和BsAb组。结论人IgG3上游铰链区/p53四价功能域基因与抗前列腺癌/抗人CD3双特异性单链抗体基因融合后表达产物的功能性亲和力和生物学活性大大提高,为提高抗体的功能性亲和力和生物学活性开辟了新的思路。
- 王栋武国军谭建明王禾
- 关键词：双特异性单链抗体PC-3细胞人IGG功能域亚克隆基因融合
- 抗人γ-精浆蛋白单链抗体四聚体的构建及表达被引量：2
- 2003年
- 目的 构建抗γ 精浆蛋白 (γ Sm )单链抗体 (scFv) /p5 3四聚功能域 ( p5 3TD)融合基因 ,并进行真核表达和活性测定。方法 利用递归聚合酶链反应 (PCR)法扩增IgG3上游铰链区与p5 3TD融合基因 ,克隆入 pUC19载体中构建 pUC19/IgG3 /p5 3克隆载体。将抗γ SmscFv克隆入该载体中 ,构建抗γ SmscFv/p5 3TD融合基因并克隆入真核表达载体 pSecTag2 B ,转染HeLa细胞表达纯化后 ,利用流式细胞仪 (FCM )进行活性测定。结果 获得了抗γ SmscFv/p5 3TD融合基因 ,基因全长 891bp ,可编码 2 97个氨基酸。表达产物经十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western印迹实验证实为约 3 5× 10 3 的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞 ,亲和力高于scFv。结论 获得了可与PC 3细胞特异结合的四价抗γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础。
- 武国军王栋于磊王禾陈宝琦袁建林
- 关键词：单链抗体四聚体基因表达
- 抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达被引量：7
- 2003年
- 目的 构建并表达抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体 ,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术 ,构建抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体融合基因 ,测序正确后 ,利用EcoRI和HindⅢ酶切位点 ,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达 ,表达产物纯化后 ,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为 1 5kb ,序列与设计完全一致 ;SDS PAGE和Western印迹实验证明 :表达产物分泌于细胞培养上清 ,相对分子质量为 6 10 0 0 ;流式细胞仪结果显示 :双特异性单链抗体与PBMC和PC 3细胞的阳性结合率分别为 5 4 1%和 5 3 7%。结论 抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性 ,为进一步的体内实验奠定了基础。
- 王栋武国军王禾杨顺良吴卫真徐廷昭谭建明
- 关键词：前列腺癌生物学活性PCR
- 抗人CD3单链抗体四聚体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定被引量：1
- 2003年
- 目的 将抗人CD3单链抗体 (scFv) /人 p5 3四聚功能域融合基因转染到HeLa细胞 ,进行真核表达和活性测定。方法 将抗人CD3scFv /人 p5 3四聚功能域融合基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果 表达产物经SDS PAGE和Westernblot证实 ,为Mr约35 0 0 0的特异蛋白条带。纯化后经流式细胞仪检测 ,可特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMCs) ,亲和力高于scFv。结论 获得了可与PBMCs特异性结合的抗人CD3scFv四聚体 。
- 武国军王禾王栋于磊王智袁建林张波药立波
- 关键词：SCFV基因HELA细胞T细胞抗原受体
- 抗人CD3单链抗体四聚体基因的构建及表达
- 2003年
- 为构建和表达抗人CD3单链抗体 (scFv) 人p5 3四聚功能域融合基因 ,选用人IgG3上游铰链区作为抗人CD3scFv和人p5 3四聚功能域之间连接的linker .利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四聚功能域融合基因 ,克隆入pUC18载体中构建pUC18 IgG3 p5 3克隆载体 .将抗人CD3scFv克隆入pUC18 IgG3 p5 3载体中 ,构建抗人CD3scFv 人p5 3四聚功能域融合基因 .经酶切鉴定及序列测定证实后 ,将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行亲和活性测定 .获得了抗人CD3scFv 人p5 3四聚功能域融合基因 ,基因全长 882bp ,可编码 2 94个氨基酸 ,与已发表的抗人CD3scFv、人IgG3上游铰链区和人p5 3四聚功能域基因cDNA序列一致 .表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约 35kD的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMC)细胞 ,亲和力高于scFv 。
- 武国军白玉杰于磊王栋王智王禾药立波
- 关键词：单链抗体融合基因T细胞抗原受体
- 抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定
- 2003年
- 目的 在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法 在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果 表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论 获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv 。
- 武国军王禾王栋于磊王智袁建林刘贺亮药立波
- 关键词：单链抗体基因表达HELA细胞流式细胞仪
- 抗前列腺特异抗原/CD3双特异单链抗体的构建及表达被引量：6
- 2001年
- 武国军王智郝晓柯王禾白玉杰张盈华药立波
- 关键词：前列腺肿瘤单链抗体
- 抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达被引量：7
- 2001年
- 目的 扩增出抗前列腺特异抗原 (PSA)单克隆抗体(MAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并在大肠杆菌中表达 .方法 从分泌抗 PSA m Ab的杂交瘤细胞系 E4B7中提取总 RNA,经 RT- PCR扩增 VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 p GEX- 4T- 1中进行表达 .结果 VH 单域抗体基因全长 36 3bp,含起始码和终止码 .将其克隆到p GEX- 4T- 1内 ,转化大肠杆菌 DH5 α,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在 .经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗 PSA VH 单域抗体 .竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性 .结论 构建成功抗 PSA的 VH单域抗体 。
- 袁建林王智武国军郝晓柯
- 关键词：前列腺特异抗原单域抗体克隆重链可变区
- 人p53四聚功能域对提高抗人CD3单链抗体亲和力的作用被引量：4
- 2006年
- 目的探讨人p53四聚功能域在提高抗人CD3单链抗体(scFv)亲和力方面的作用。方法利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p53四聚功能域融合基因,克隆入pUC19载体中构建pUC19/IgG3/p53克隆载体。将抗人CD3scFv克隆入pUC19/IgG3/p53载体中,构建抗人CD3scFv/人p53四聚功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后,将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2-B中,转染HeLa细胞进行表达,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果获得了抗人CD3scFv/人p53四聚功能域融合基因,基因全长882bp,可编码294个氨基酸,与已发表的抗人CD3scFv、人IgG3上游铰链区和人p53四聚功能域基因cDNA序列一致。表达产物经SDS-PAGE和Western印迹实验证实为约35kD的特异蛋白条带,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合人外周血单个核细胞(PBMC)细胞,亲和力高于scFv。结论人IgG3上游铰链区/p53四聚功能域基因与抗人CD3scFv基因融合后表达产物的功能性亲和力大大提高,为提高抗体的功能性亲和力开辟了新的思路。
- 武国军王栋王禾袁建林白玉杰于磊张更王智
- 关键词：CD3单链抗体融合基因
- 抗PSA单链抗体/p53四聚功能域融合基因的构建及表达被引量：1
- 2003年
- 目的 :构建抗人前列腺特异抗原 (PSA)单链抗体 (scFv) /人 p5 3四聚功能域融合基因 ,并进行真核表达和活性测定。方法 :利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人 p5 3四聚功能域融合基因 ,克隆入 pUC19载体中构建pUC19/IgG3/p5 3克隆载体。将抗PSAscFv克隆入pUC19/IgG3/ p5 3载体中 ,构建抗PSAscFv/人p5 3四聚功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后 ,将融合基因克隆入真核表达载体 pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果 :获得了抗PSAscFv/人p5 3四聚功能域融合基因 ,基因全长 891bp ,可编码 2 97个氨基酸 ,与已发表的抗PSAscFv、人IgG3上游铰链区和人p5 3四聚功能域基因cDNA序列一致。表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约 35kD的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞 ,亲和力高于scFv。结论 :获得了可与PC 3细胞特异结合的抗PSAscFv四聚体 。
- 武国军王栋于磊王禾郝晓柯袁建林
- 关键词：前列腺特异抗原融合基因
