四川省重点科技攻关项目(05JY029-109)
- 作品数：18 被引量：121H指数：7
- 相关作者：汪铭书程安春陈孝跃刘晓东韩新锋更多>>
- 相关机构：四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室河南省漯河市双汇实业集团有限责任公司更多>>
- 发文基金：四川省重点科技攻关项目教育部“新世纪优秀人才支持计划”四川省重点科学建设项目更多>>
- 相关领域：农业科学轻工技术与工程生物学更多>>
- 规模化鸭场鸭源致病性沙门氏菌的药物敏感性检测及耐药性分析被引量：17
- 2008年
- 钟传德程安春汪铭书李玲段泽于小娜仲崇岳陈孝跃
- 关键词：致病性沙门氏菌耐药性分析药物敏感性鸭源规模化猪霍乱沙门氏菌
- 荧光定量PCR检测小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠体内的动态分布
- 2008年
- 刘晓东程安春汪铭书韩新锋卢菲黎敏陈孝跃
- 关键词：小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测基因疫苗VP3小鼠
- 间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立被引量：8
- 2008年
- 【目的】建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒(DSHDV)的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDVIgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为:切片在0.01mol·L-1柠檬酸(pH6.0)缓冲液微波修复20min后,以10%马血清37℃下封闭30min,然后加入1﹕50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1﹕100FITC标记的含0.01%伊文斯蓝的二抗37℃孵育30min。IFA检测DSHDV感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆。经甲醛固定保持1～6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏,IFA检测结果也呈阳性。DSHDV具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段核酸,呈"334"分布。【结论】建立的检测石蜡组织切片中DSHDV抗原的IFA具有直观、特异性强的优点,应用于DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。DSHDV抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。
- 张舍郁程安春汪铭书沈婵娟李传峰
- 关键词：间接免疫荧光抗原定位
- 鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用被引量：9
- 2007年
- 根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以109PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果。
- 程安春于小娜汪铭书朱德康李玲孙磊陈孝跃
- 关键词：PILA基因原核表达
- 鸭病毒性肿头出血症病毒培养特性与形态观察被引量：1
- 2007年
- 试验对鸭病毒性肿头出血症病毒在鸭胚上的培养特性、毒力、病毒的纯化及其形态进行了研究。结果表明:该病毒不能感染鸡胚,能在鸭胚上繁殖并传代,在鸭胚上的半数致死量为1×10^(-7.24)/0.2mL;氯化铯超速离心纯化的病毒效果优于蔗糖离心法,电镜观察病毒粒子呈球形或椭圆形,大小为60～80nm,无囊膜。
- 张舍郁程安春汪铭书
- 关键词：病毒提纯病毒形态
- 实时荧光定量PCR检测鸭疫里默氏杆菌方法的建立和应用被引量：11
- 2008年
- 根据我们实验室发现的鸭疫里默氏杆菌(RA)荚膜多糖蛋白基因序列(DQ151838),设计和合成荧光定量PCR引物和探针,建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。该法的表达式Y=-3.416X+39.492,相关系数1.000,PCR循环效率96.2%,DNA拷贝数在100～108范围内检测曲线有良好的线性关系。该法的最适Mg2+、引物和探针浓度分别为4～5mmol/L、0.16～0.2μmol/L和0.16μmol/L,最低能够检测到RA的DNA模板为2.0copies/μL。1/10半数致死量的RA人工皮下注射感染7日龄樱桃谷鸭后2h即可在心、肝、肺、胸腺、食管中检测到RA核酸;感染后8h即可在心、肝、脾、肺、肾、脑、胰、食管、气管、胸腺、法氏囊、十二指肠、直肠、血液和咽喉拭子检测到RA核酸,36～120h是RA在感染雏鸭除了咽喉、食管和气管各个组织器官繁殖数量最高峰期,其后逐渐下降。RA人工感染致死雏鸭的心、肝、脑RA分离和FQ-PCR检测符合率为100%。对临床送检具有典型鸭疫里默氏杆菌病临床症状和病理变化的死亡雏鸭的肝脏、心血和脑组织的FQ-PCR检测的阳性率均为100%,而RA分离的阳性率分别只有74.3%(26/35)、82.9%(29/35)和91.4%(32/35)。FQ-PCR可用于鸭疫里默氏杆菌感染的快速诊断、流行病学调查和鸭产品的检疫等。
- 段泽程安春汪铭书朱德康仲崇岳钟传德于小娜李玲陈孝跃
- 关键词：荧光定量PCR
- 鸭IFN-α真核表达质粒基因枪免疫对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭细胞免疫调节作用初探被引量：3
- 2007年
- 为探索鸭α干扰素(IFN-α)真核表达质粒(pcDNA-SDIFN-α)对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭的细胞免疫调节作用,本研究将pcDNA-SDIFN-α以1、3和6μg/只3个剂量用基因枪轰击法分别免疫28日龄鸭,以PBS和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,所有鸭15 d后接种鸭瘟(DP)弱毒疫苗。接种后第3、7、14、21、28、35、49、63、84天采血用淋巴细胞增殖试验(MTT法)测定鸭外周血中T淋巴细胞转化效果;第7、14、21、28、35、49天采血用流式细胞仪(FACS)测定CD3+T淋巴细胞数量的动态变化。结果发现:①T淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值),不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭外周血T淋巴细胞转化功能于第3-84天均高于PBS和空载体pcDNA对照组,其中第3-84天1μg/只组极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组;1μg/只组第3-35天显著(P≤0.05)高于3、6μg/只组;3μg/只组于第14-35天高于6μg/只组,但差异不显著(P≥0.05);pcDNA对照组略高于PBS对照组,但差异不显著(P≥0.05);②CD3+T淋巴细胞数量变化,不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭于第7-49天均高于PBS和pcDNA对照组,其中1μg/只组于第14-49天极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组于第21-49天极显著(P≤0.01)高于PBS对照组和显著(P≤0.05)高于pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天显著(P≤0.05)或极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组;1、3和6μg/只组之间差异不显著(P≥0.05);pcDNA组于第14-49天高于PBS组,但差异不显著(P≥0.05)。研究表明,pcDNA-SDIFN-α提前15 d免疫能显著增强DP弱毒疫苗诱导的鸭细胞免疫力,以基因枪免疫1μg/只的效果最佳,它是一种良好的增强DP弱毒疫苗细胞免疫的分子佐剂。
- 程志萍程安春汪铭书陈斌刘闯段坤周雪陈孝跃
- 关键词：基因枪鸭瘟弱毒疫苗细胞免疫分子佐剂
- 沙门菌外膜蛋白的免疫学研究进展
- 2008年
- 张振华程安春汪铭书
- 关键词：免疫学技术外膜蛋白沙门菌机体免疫系统基因检测OMP
- 我国部分地区规模化鸭场鸭源致病性沙门氏菌的药物敏感性检测及耐药性分析
- 采用WHO推荐的Kirby-Bauer法对我国16个地区规模化鸭场1999-2005年间感染沙门氏菌的患病和死亡鸭所分离到的175株鸭源致病性沙门氏菌进行了药敏试验。结果表明,菌株对37种抗菌药物的药敏结果令人吃惊,耐药...
- 钟传德程安春汪铭书李玲段泽于小娜仲崇岳陈孝跃
- 关键词：规模化鸭场致病性沙门氏菌耐药性
- 文献传递
- 荧光定量PCR检测基因枪轰击免疫小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠体内的动态分布被引量：4
- 2007年
- 开展了检测小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因的荧光定量PCR(FQ-PCR)的建立和基因枪轰击不同剂量(6μg/只、3μg/只和1μg/只)GPV-VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)在BALB/c小鼠各组织器官(心、肝、脾、肺、肾、脑、肠和免疫部位皮肤)分布规律的研究。结果表明:①建立的FQ-PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值具有很好的直线相关性(相关系数达到0.999);②pcDNA-GPV-VP3在各剂量免疫小鼠1h即可在各组织中被检测到,其中在免疫部位皮肤含量最高,在心与肺中含量也较高,在脑中含量最低;③pcDNA-GPV-VP3在组织器官里的含量于3h开始下降,31wk仍能在3个剂量免疫组小鼠的各个组织器官中检测到,但多数组织器官中的含量比1h时约少了102,免疫部位皮肤减少了103;④不同剂量免疫组各组织器官中pcDNA-GPV-VP3含量6μg/只组>3μg/只组>1μg/只组,但剂量组之间的差异并不显著(P>0.05)。研究表明:FQ-PCR是定量检测pcDNA-GPV-VP3在免疫小鼠各组织器官含量的可靠实验手段,pcDNA-GPV-VP3免疫小鼠后1h时可分布至小鼠体内各组织器官中并持续存在31wk以上。
- 刘晓东程安春汪铭书韩新锋卢菲黎敏陈孝跃
- 关键词：荧光定量PCR小鹅瘟病毒VP3基因疫苗基因枪小鼠
