江苏省自然科学基金(BK2004047)
- 作品数：9 被引量：76H指数：5
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- 糖元合成酶激酶3β对微管相关蛋白tau的磷酸化作用被引量：13
- 2007年
- tau蛋白是中枢神经系统中重要的微管相关蛋白,其功能受磷酸化调节.异常过度磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默病患者脑中神经纤维缠结的主要组成部分.糖元合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是重要的tau蛋白激酶之一,它虽可催化tau蛋白多个位点的磷酸化,但对不同位点,其催化效率不同.通过位点特异性、磷酸化依赖的tau蛋白抗体,用免疫印迹技术,检测GSK-3β对tau蛋白位点特异性的磷酸化作用及动力学.用双倒数作图,计算GSK-3β催化tau磷酸化以及各个位点磷酸化的Km值,并结合培养细胞中的实验,研究GSK-3β对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性.结果显示,GSK-3β催化tau蛋白多个位点的磷酸化,其中包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Thr231、Ser396和Ser404,对不同的位点磷酸化作用,其Km值不同,GSK-3β对Ser396的Km值最低,即对Ser396位点的亲和性最高,催化其磷酸化的能力最强.在培养的细胞中,也显示了GSK-3β的表达引起Ser396位点的磷酸化最明显.
- 刘飞施建华丁绍红尹晓敏
- 关键词：TAU磷酸化
- 微管相关蛋白tau在动物死亡后被快速去磷酸化被引量：3
- 2005年
- tau蛋白是神经细胞中主要的微管相关蛋白,它的异常过度磷酸化被认为是阿尔茨海默病(AD)致病过程中的关键因素.由于法律、社会、家庭等诸多因素使得获取的人脑组织标本常常在死亡后2￣3h以上,因此了解死亡不同时间后tau蛋白磷酸化的改变,对研究tau蛋白的功能及在AD致病过程中作用显得十分重要.用位点特异的、磷酸化依赖的抗tau蛋白抗体检测正常大鼠脑中tau蛋白磷酸化程度及死亡后其磷酸化的变化情况,再用非同位素的点印迹技术测定鼠脑中tau蛋白激酶、磷酸酶在不同温度下的活性.结果发现,正常鼠脑中tau蛋白除了Ser262,Ser409,Ser422外,在Thr181,Ser199,Ser202,Thr205,Thr212,Ser214,Thr217,Ser396和Ser404存在不同程度的磷酸化,并且在死亡后3h,出现tau的多位点的去磷酸化及tau蛋白迁移加快,6h后更为明显,但tau蛋白水平即使在大鼠死亡后6h,仍未见有明显的改变.用点印迹测定蛋白激酶和磷酸酶活性结果显示,tau蛋白激酶、磷酸酶活性均有温度依赖性降低,在25℃时激酶活性降低远大于磷酸酶活性的降低,tau蛋白在死亡后的快速去磷酸化与相对高的磷酸酶作用有关.
- 殷冬梅施建华顾建兰沈勤龚成新刘飞
- 关键词：TAU蛋白质磷酸化阿尔茨海默病
- 姜黄素对脂多糖激活的小胶质细胞iNOS表达的抑制及抗氧化作用被引量：28
- 2007年
- 用姜黄素预处理小胶质细胞株BV,1h后加用脂多糖(200ng/ml)进行刺激,通过MTT检测细胞活性;硝酸还原酶法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;Western印迹、免疫细胞化学染色检测细胞活化后形态及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表达;瞬时转染和荧光素酶报告基因鉴定iNOS和NF-κB基因表达活性;SOD和GSH-Px检测姜黄素的抗氧化能力.结果证明,脂多糖可促使小胶质细胞活化,使iNOS和NF-κB基因表达活性显著增强;iNOS蛋白表达明显上调,NO释放增多;细胞内SOD和GSH-Px活性明显下降.而姜黄素(10μmol/L)可以显著抑制活化后小胶质细胞NO的产生、iNOS蛋白的表达及iNOS-Luc、NF-κB-Luc的表达活性,其机制可能通过NF-κB的信号转导途径抑制iNOS的表达.姜黄素可通过提高细胞内SOD和GSH-Px的活性发挥抗氧化作用.
- 杨开艳顾建兰殷冬梅沈勤
- 关键词：小胶质细胞姜黄素诱导型一氧化氮合酶
- 姜黄素对脂多糖激活的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用被引量：6
- 2007年
- 目的：观察姜黄素对脂多糖激活的小胶质细胞NO的产生及iNOS表达的影响。方法：用脂多糖（200ng／m1）刺激小胶质细胞株BV的同时用不同浓度姜黄素进行干预，应用MTT方法检测细胞活性；硝酸还原酶法检测细胞上清液中NO的含量；Western—blot及免疫细胞化学染色方法检测iNOS蛋白的表达。结果：姜黄素在2．5～20μmol／L范围内对细胞活性无影响；脂多糖作用24h后，NO释放量明显增加，iNOS蛋白表达明显增强；使用姜黄素干预后，浓度在10μmol／L时可以显著抑制脂多糖激活的小胶质细胞NO的产生和iNOS蛋白的表达。结论：姜黄素能够有效抑制脂多糖激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达以及NO的产生。
- 杨开艳顾建兰施建华沈勤
- 关键词：姜黄素脂多糖小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶
- PKA、GSK-3β和cdk5对微管相关蛋白tau的位点特异性磷酸化被引量：19
- 2006年
- 目的:研究cAMP依赖的蛋白激酶(cAMPdependentproteinkinase,PKA)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和细胞周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependentkinase5,cdk5)在体外和培养的细胞中对tau蛋白位点特异性磷酸化的调节作用。方法:以人最长的异构体tau441作为底物,通过蛋白质印迹分析,观察以上3种酶对tau蛋白位点特异性磷酸化的调节作用。结果:PKA在体外能够磷酸化Ser214、Ser262、Ser409,但在培养的细胞中,PKA的激活仅使得tau蛋白在Ser214位点的磷酸化增加,而不能磷酸化Ser262和Ser409。在体外和培养的细胞中,GSK-3β和cdk5均能磷酸化tau蛋白许多位点,包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Ser396、Ser404,使得tau蛋白的迁移减慢。结论:在培养的细胞中,PKA的激活使得tau蛋白在Ser214位点的磷酸化增加。GSK-3β能更好地磷酸化tau蛋白微管结合域下游的磷酸化位点,而cdk5则更容易磷酸化其上游的位点。
- 丁绍红施建华尹晓敏龚成新刘飞
- 关键词：TAU蛋白激酶
- 阿尔茨海默病模型建立及干预实验研究进展被引量：4
- 2007年
- 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种与衰老相关，以认知功能下降为特征的渐进性脑退行性疾病。AD患者整个大脑弥散性萎缩并出现明显的病理组织学改变——老年斑和神经纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）。并伴神经元减少，其中以基底前脑核海马区胆碱能神经元最严重。神经元细胞外淀粉样蛋白（amyloid β—protein，Aβ）沉积形成老年斑。晚期Aβ沉积激活小胶质细胞和星形胶质细胞引发了炎性反应，活化的胶质细胞围绕在斑块周围。由于AD是多因素引起。涉及多种病理机制的多因异质性疾病，因此建立一种理想的AD模型困难重重，影响了AD的深入研究．本文就近年来国内外AD动物模型的建立及相关的干预实验作一综述。
- 杨开艳沈勤
- 关键词：阿尔茨海默病干预实验
- 炎症胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶基因转录的机制被引量：6
- 2006年
- 目的:通过瞬时转染p38MAPK途径中上游激酶,组成激活型MAPK激酶3和MAPK激酶6,进一步了解p38MAPK级联传导信号系统调节诱导型一氧化氮合酶基因在胶质细胞中的转录激活机制。方法:实验于2003-01/2004-08在美国南卡洲医科大学神经科学研究室和南通大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室进行。采用MAPK激酶3和MAPK激酶6表达质粒与接有荧光素酶的大鼠诱导型一氧化氮合酶启动基因质粒;cAMP反应元件和核因子-κB联合转染C6胶质细胞株。测定荧光素酶活性,观察诱导型一氧化氮合酶基因激活表达机制。结果:①MKK3b/MKK6b能引起诱导型一氧化氮合酶启动基因质粒的激活,并都能够被p38MAPK抑制剂SB203580所抑制。②MKK可以诱导cAMP反应元件介导的和核因子-κB依赖的转录活性。③显性抑制型CRE结合蛋白和CCAAT/增强子结合蛋白都是p38MAPK的靶向作用目标,转染这两种转录因子产生相反的影响:显性抑制型CRE结合蛋白增强了诱导型一氧化氮合酶启动基因质粒的表达,而显性抑制型CCAAT/增强子结合蛋白则引起抑制作用,对cAMP反应元件也具有相同的影响。④此外,激活型MAPK激酶3和MAPK激酶6诱导诱导型一氧化氮合酶启动子的激活能够被野生型活化转录因子增强。然而磷酸化缺陷型的野生型活化转录因子则起抑制作用。结论:转录因子的靶向作用特点,对于炎症反应中NO的过量产生具有选择干扰性,在临床上具有实用价值。
- 沈勤施建华顾建兰殷冬梅张然
- 关键词：细胞外信号调节MAP激酶类一氧化氮合酶
- 蛋白激酶A催化微管相关蛋白tau磷酸化的研究被引量：3
- 2006年
- 目的:研究蛋白激酶A(PKA)对微管相关蛋白tau的磷酸化作用。方法:采用免疫印迹技术,利用位点特异性、磷酸化依赖的tau蛋白抗体,检测PKA对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性及磷酸化作用动力学。用双倒数作图,计算PKA催化tau磷酸化以及各个位点磷酸化的Km值,并结合培养细胞的实验,研究PKA对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性。结果:PKA催化tau蛋白在Ser214,Ser262,Ser409三个位点磷酸化,而且各位点磷酸化作用的Km值不同,PKA对Ser214的Km值最低,即对Ser214位点的亲和性最高,催化其磷酸化的能力最强。在细胞实验中,也显示了PKA引起Ser214位点的磷酸化最明显。结论:PKA催化tau蛋白在Ser214,Ser262,Ser409三个位点磷酸化,其中Ser214是PKA催化tau磷酸化反应的最好位点。
- 施建华钱慰丁绍红尹晓敏沈勤刘飞
- 关键词：TAU蛋白激酶A磷酸化
- 剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达被引量：1
- 2007年
- 目的:本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法:用PCR法扩增SRp55基因,将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠,亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果:SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达,随诱导时间的增加蛋白表达量增高,4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白,经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST-SRp55融合蛋白,为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。
- 尹晓敏施建华刘飞
- 关键词：TAU原核表达剪接因子
