江苏省自然科学基金(BK2004041)
- 作品数：9 被引量：11H指数：2
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- Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选及鉴定
- 2007年
- 本研究以人B细胞淋巴瘤Daudi细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞RNA出发，用基因克隆技术将B细胞全套k轻链和重链Fd片段基因克隆出来，组装到表达载体pComb3H—SS内并表达到噬菌体表面，构建出Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Daudi细胞为抗原对抗体库筛选后，获得针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系膜抗原的抗体。
- 申咏梅杨晓春董宁征白霞
- 关键词：DAUDI细胞噬菌体抗体库FABB细胞淋巴瘤基因克隆技术
- B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库的构建
- 2006年
- 目的构建B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库。方法从人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞免疫的BALB/c小鼠脾细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增免疫球蛋白轻链κ基因及重链Fd片段,然后经酶切、纯化、连接等步骤将轻链κ基因和重链Fd片段依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue。结果构建了抗人B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库,轻链κ基因、重链Fd片段与载体的重组率分别为100%和78%,库容量为2.18×107。结论成功构建了抗人B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库,方便进一步筛选抗人B细胞淋巴瘤抗体。
- 申咏梅杨晓春董宁征谢小芳白霞
- 关键词：B细胞淋巴瘤FAB噬菌体抗体库
- Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定被引量：3
- 2009年
- 目的:构建针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定。方法:以Daudi细胞免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗血清滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取RNA。利用RT-PCR扩增抗体к轻链和重链Fd片段,经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS的相应酶切位点,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Daudi细胞为抗原对抗体库进行6轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,获得的阳性克隆进一步做DNA序列测定、在大肠杆菌XL1-Blue中进行可溶性表达,并用Western blot对表达产物的特异性作了鉴定。结果:构建了容量为3.13×107的抗人B细胞淋巴瘤Daudi细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Daudi细胞系特异性识别结合的4株阳性克隆。氨基酸序列分析结果显示:阳性克隆的重链、轻链可变区序列分别与基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链、轻链可变区序列有80%～94%和88%～95%同源性。阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达,Western blot结果表明所获得的可溶性表达产物可与Daudi细胞膜抗原特异性结合。结论:成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Daudi细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。
- 申咏梅杨晓春董宁征白霞
- 关键词：B细胞淋巴瘤FAB噬菌体抗体库
- Bcl-2反义寡核苷酸与Rituximab联合对Raji细胞增殖和凋亡的影响
- 2007年
- 目的：研究bcl-2硫代反义寡核苷酸（bcl-2 ASODN）联合Rituximab[CD20单克隆抗体（mAb）]对B细胞淋巴瘤Raji细胞株体内外增殖和凋亡的影响, 并探讨其作用机制.方法：bcl-2 ASODN和Rituximab分别和联合作用B细胞淋巴瘤Raji细胞后, 通过MTT法检测细胞生长情况;流式细胞术（FCM）检测bcl-2蛋白表达和细胞凋亡;RT-PCR检测bcl-2 mRNA表达水平;用Raji细胞建立裸鼠B细胞淋巴瘤模型观察bcl-2 ASODN与Rituximab联合在体内的抗肿瘤效果. 结果：5～30 μmol/L bcl-2 和1 ～16 mg/L Rituximab单独应用均能抑制Raji细胞生长、诱导细胞凋亡、使bcl-2蛋白和bcl-2 mRNA表达降低, 但两者联合应用较单独应用抑制作用更为明显（P＜0.01）.体内实验表明, bcl-2 ASODN与Rituximab联合应用较单独可有效抑制BALB/c裸鼠B细胞淋巴瘤的生长（P＜0.01）.结论：bcl-2 ASODN联合Rituximab较分别单独应用可明显抑制B细胞淋巴瘤Raji细胞生长, 促进细胞凋亡;其机制可能是通过联合下调bcl-2蛋白及bcl-2 mRNA表达而起作用.
- 申咏梅杨晓春石怡珍谢小芳唐军
- 关键词：BCL-2反义寡核苷酸RITUXIMAB
- 抗人B细胞淋巴瘤噬菌体单链抗体库的构建被引量：2
- 2006年
- 目的构建抗人B细胞淋巴瘤单链抗体(ScFv)库。方法从人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞免疫的BALB/c小鼠脾细胞中提取mRNA,RT-PCR扩增重、轻链可变区基因片断,连接成ScFv基因并扩增,将其克隆到噬菌体载体pHEN1中,构建成单链噬菌体抗体库。结果抗体库容量为3.4×106,约100%的噬菌体基因中有ScFv基因的插入。结论成功构建了抗人B细胞淋巴瘤噬菌体单链抗体库,方便进一步筛选抗人B细胞淋巴瘤抗体。
- 申咏梅周俊东杨晓春董宁征吴锦昌
- 关键词：B细胞淋巴瘤单链抗体
- bcl-2 RNAi表达载体的构建、鉴定及其对Raji细胞的干扰效果被引量：1
- 2009年
- 目的构建bcl-2特异性RNAi真核细胞质粒表达载体,并研究其对B细胞淋巴瘤Raji细胞的干扰效果。方法根据GenBank提供的bcl-2cDNA序列,设计并合成两对短发夹结构的互补DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至载体pGenensil-1构建重组质粒,予以酶切和DNA测序鉴定。脂质体介导重组质粒转染Raji细胞,采用RT-PCR法观察重组质粒对bcl-2mRNA表达的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建bcl-2shRNA的质粒表达载体pGenesil-1-bcl-2-544和pGenesil-1-bcl-2-1009。转染Raji细胞48h后,RT-PCR结果显示Raji细胞中bcl-2mRNA表达分别下调了(31.95±3.02)%和(47.57±2.88)%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示Raji细胞凋亡率分别为(14.25±0.84)%和(11.96±0.79)%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建bcl-2特异性RNAi真核细胞质粒表达载体,它能有效沉默bcl-2基因在B细胞淋巴瘤中的表达并促进B细胞淋巴瘤Raji细胞凋亡。
- 秦陈浩申咏梅宋妙丽冯萍
- 关键词：RNAIBCL-2B细胞淋巴瘤RAJI细胞
- ^131I标记B细胞淋巴瘤Fab抗体荷瘤裸鼠体内分布和显像被引量：1
- 2008年
- 目的研究^131I标记B细胞淋巴瘤Fab抗体^131I-Fab抗体）在荷人B细胞淋巴瘤裸鼠体内的分布和放射免疫显像效果。方法应用免疫组织化学和流式细胞仪检测经噬菌体抗体库技术获得的B细胞淋巴瘤Fab抗体的免疫活性。以Iodogen法对Fab抗体和CD20单克隆抗体（简称单抗，对照）进行^131I标记。标记物经尾静脉注入荷瘤裸鼠后2，4，8和24h分别进行显像，并测定荷瘤裸鼠体内主要组织的放射性分布。结果免疫组织化学和流式细胞仪检测结果表明Fab抗体和^131I-Fab抗体均能与Raji细胞膜抗原结合，结合率〉87％。显像结果显示^131I-Fab抗体在注入荷瘤裸鼠体内8h即可使肿瘤清晰显影，24h基本被清除.^131I—CD20单抗注入后24h肿瘤可见放射性浓聚。荷瘤裸鼠体内分布结果表明在2，4和8h^131I-Fab抗体组肿瘤每克组织百分注射剂量率（％ID／g）分别为（1．37±0．28），（1．84±0．13）和（2．21±O．15）％ID／g，均高于对照组[分别为（0．33±0．06），（0．62±0．08）和（1．46±0．z4）％ID／g；F=52．22，278．42和29．00，P均〈0．05]，24h则明显低于对照组[分别为（0．44±O．ar7）和（3．56±0．66）％ID／g；F=89．7，P〈0．05]。2，4，8，24h ^131I-Fab抗体组肿瘤／非肿瘤组织放射性（T／NT）比值分别为（0．22±0．03）～（5．44±0．31），（0．43±0．11）～（21．01±3．97），（1．09±0．07）～（20．28±2．77），（1．12±0．02）～（10．29±1．78）；而对照组T／NT比值分别为（0．04±0．01）～（3．10±0．29），（0．11±0．05）～（7．99±1．81），（0．48±0．06）～（23．55±1．69），（2．32±0．34）～（33．23±6．83）。结论^131I-Fab抗体具有相对分子质量小、活体定位准确高效、显像早和清除快速等优点，对临床放射免疫显像诊断B细胞淋巴瘤具有潜在的应用价值。
- 杨晓春申咏梅石怡珍张梅花刘增礼沈钧康
- 关键词：抗体碘放射性同位素放射免疫检测
- ^(131)I标记B细胞淋巴瘤Fab抗体荷瘤裸鼠治疗及磁共振影像分析被引量：1
- 2009年
- 将荷人B细胞淋巴瘤裸鼠分为对照组、Fab抗体组、单次注射组和重复注射组,尾静脉注射131I-Fab抗体后进行ECT显像;每隔5d用MRI结合显微镜线圈检测荷瘤裸鼠的肿瘤大小。注射后25d,取出肿瘤,进行病理分析、流式细胞术和电镜检测细胞凋亡。结果显示,131I-Fab抗体静脉注射后8h在肿瘤局部浓集明显,瘤体清晰显像;Fab组5d内具有抑制肿瘤生长作用,凋亡率为(2.48±0.6)%;单次131I-Fab注射组早期抑制肿瘤生长较明显,肿瘤生长出现平台期,凋亡率为(10.67±1.6)%;131I-Fab抗体重复注射组抑制肿瘤生长作用明显,肿瘤局部坏死脱落,凋亡率为(14.00±1.9)%。病理结果显示两注射组均可见组织坏死。MRI图像与病理结果相符,通过造影剂增强可提供较准确的病理信息。表明131I-Fab抗体具有早期ECT肿瘤显像、瘤体准确定位,并通过致凋亡和直接促使细胞死亡的作用而有效抑制肿瘤生长,大型高场强MRI可为小动物模型实验提供有效、无创、动态的监测。
- 杨晓春申咏梅石怡珍谢小芳
- 关键词：淋巴瘤B细胞抗体碘-131放射免疫治疗磁共振
- Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选被引量：6
- 2007年
- 目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。
- 谢小芳申咏梅杨晓春董宁征白霞石怡珍
- 关键词：B细胞淋巴瘤FAB噬菌体抗体库
