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枯草芽孢杆菌sacB基因的功能验证及应用被引量：6: 2008年; 本研究将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA中克隆的1.4 kbsacB基因片段连接到表达载体pET-28a(+),构建了sacB基因表达载体pSacB。通过测定蔗糖水解产生的葡萄糖具有的还原性,确定sacB基因产物具有蔗糖果聚糖酶活性。该基因表达后,导致大肠杆菌(Escherichia coli)细胞不能在含5%蔗糖的培养基中生存。同时发现sacB基因也能赋予耐辐射菌株Deinococcussp.BR501蔗糖敏感性。利用条件致死sacB基因的这一特性,我们分析了D.sp.BR501的突变率,结果表明DNA错配修复缺失突变株(ΔmutS1)的突变频率明显高于野生型。因此枯草芽孢杆菌sacB基因可作为验证DNA损伤修复能力的一种筛选标记。; 吴菁刘秀敏张维陈明林敏; 关键词：枯草芽孢杆菌突变率

固氮斯氏假单胞菌铵载体amtB基因的功能和结构分析被引量：1: 2007年; 固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是分离自水稻根际的联合固氮细菌,属变形细菌γ亚族。全基因组序列分析表明该菌含有2个紧密连锁的的铵载体蛋白编码基因amtB1和amtB2,位于同一个操纵子中glnK基因下游。铵载体蛋白AmtB1和AmtB2分别包含12和11个跨膜结构域。为研究amtB的功能,构建了amtB极性双突变株(PKOB1)。amtB极性双突变导致菌株生长缓慢;在铵浓度分别为3.3和10mmol/L条件下,其固氮酶活仍保持在0.01mmol/L的最佳固氮条件的87%和74%,而野生型已经基本尚失固氮能力。以硝酸盐为唯一氮源时,突变株细胞培养液的铵浓度可达到3.4mmol/L,而野生型并未检测到铵,表明AmtB可能参与了P.stutzeriA1501的铵离子转运,并与固氮酶活和氮代谢相关。; 侯胜强何升窦岳坦平淑珍林敏陈明; 关键词：斯氏假单胞菌A1501 跨膜结构 AMTB

极端耐辐射奇异球菌Deinococcus sp.BR501切除修复系统突变株的构建及功能的鉴定被引量：1: 2007年; 极端辐射异常球菌Deinococcussp.BR501的核苷酸切除修复系统,可能包含两条途径:依赖于UV损伤内切酶β(UvsE)的修复途径和依赖于UV损伤内切酶α(UvrABC)的修复途径,其关键酶分别为UvsE(dr1819编码)和UvrABC(A亚基dr1771编码)。根据Deinococcus radiodurans的序列,采用同源克隆的方法,设计PCR引物、克隆基因和体外阻断目的基因,再通过PCR产物线性转化的方法,筛选到同源双交换的重组阻断突变株△dr1771、△dr1819和△dr1771与△dr1819的双突变株。对此突变株和野生型均进行UV辐射抗性和化学损伤试剂MMC与H2O2的损伤修复能力的分析。结果表明了BR501中两条核苷酸切除修复途径的存在,并且只有两条途径同时缺失时,才能使菌体对UV和DNA交联剂MMC敏感。; 刘秀敏吴菁张维陆伟平淑珍林敏陈明; 关键词：DEINOCOCCUS 切除修复

一株极端耐辐射奇异球菌的分离和初步鉴定被引量：3: 2007年; 从放射性污染的土壤样品中分离出1株具有极端耐辐射的微生物BR501,该菌最适生长温度为30℃,不具有氨苄青霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素和利福平等抗性。UV、γ辐射生长曲线的结果显示BR501菌株具有极强的辐射抗性。BR501菌株的16S rDNA序列与多株Deinococcus属菌株有很高的同源性,其中,与D.radiodurans菌株的16S rDNA相似性高达99%。结合BR501菌株的表型和Deinococcus属具有代表性的D.RadioduransR1菌株的特征,将该菌株归属为Deinococcus属,初步命名为Deinococcus sp.BR501。; 陈明刘秀敏张维林敏; 关键词：DEINOCOCCUS SP RDNA

利用宏基因组文库筛选草甘膦不敏感的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶（EPSPS）基因被引量：2: 2006年; 为探索利用宏基因组文库筛选草甘膦不敏感的5-烯醇式丙酮莽革酰-3-磷酸合酶（EPSPS）基因，直接从土壤中提取细菌DNA，构建草甘膦污染土壤细菌宏基因组文库，并利用EPSP合酶缺失突变株ER2799筛选到4个能互补EPSP合酶功能的克隆，其中两个克隆的转化子能够在含5mmol／L草甘膦的MOPS培养基上生长。测序结果表明它们均含有完整的EPSP合酶编码基因，GT-1aroA核苷酸长度为1335bp，编码445个氨基酸，GT-4aroA核苷酸长度为1350bp，编码450个氨基酸。利用PCR方法将两个基因克隆到原核表达载体pET28a上后，可以使宿主细胞BL21（DE3）在含100mmol／L草甘膦的MOPS培养基中良好生长。上述结果表明，利用宏基因组文库筛选方法可以得到高抗草甘膦的EPSPS基因。; 陆伟梁爱敏孟秀萍顿宝庆金丹穆文超林敏; 关键词：草甘膦

荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复被引量：1: 2006年; 利用GPS-LS接点扫描系统,在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp(即编码5个氨基酸短肽)的外源片段,建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库．利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选,测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点,其中位点F295／T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点．从位点F295／T296将G2-EPSPS基因一分而二,N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE内含子元件的原核表达双质粒上,获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSc296Ic．将质粒pMEPSN295IN和pKEPSc296Ic分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中,携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长,而携带单一质粒的不能生长,表明从位点F295／T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建,在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性,酶活水平达到野生型的62．92％,为4．48 U/mg．; 顿宝庆陆伟张维平淑珍王旭静陈明徐玉泉金丹王劲赵仲麟梁爱敏侯松娜Ming-Qun Xu林敏

新型高抗草甘膦N-乙酰转移酶基因的分离及其在大肠杆菌中的表达被引量：5: 2006年; 利用草甘膦极端污染土壤总DNA,构建了元基因组文库,筛选到一个高抗草甘膦的N-乙酰转移酶（N-acetyltransferase,GAT）基因,并利用原核表达系统对该基因进行了功能鉴定,发现其在大肠杆菌BL21中能耐受高达300 mM的草甘膦.研究结果为进行N-乙酰化途径高抗草甘膦机理研究和新型高抗草甘膦转基因作物的开发提供了理论基础.; 顿宝庆陆伟平淑珍张维陈明徐玉泉金丹赵仲麟林敏; 关键词：大肠杆菌表达

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国家高技术研究发展计划(2004AA214170)