国家自然科学基金(30700347)
- 作品数：7 被引量：24H指数：4
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- 低氧致人肺动脉平滑肌细胞PKGIa表达变化与细胞表型的研究被引量：2
- 2008年
- 目的观察低氧对人肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)细胞表型的影响以及不同细胞表型下蛋白激酶G Ia(protein kinase GIa,PKGIa)mRNA及其蛋白表达水平变化,探讨PKGIa信号途径与低氧PASMCs表型转换中的可能调控作用。方法组织块法培养人PASMC。采用RT-PCR和免疫细胞化学法检测常氧组(N组)、低氧12、24h组PASMCs内平滑肌α肌动蛋白(smooth muscle α actin,SM-α-actin)mRNA及蛋白的表达水平变化;同时采用RT-PCR及Western blot检测PKGIa基因mRNA以及相应的蛋白的表达水平。结果各组均检测出SM-α-actin、PKGIa的mRNA以及蛋白表达的变化。低氧刺激下,PASMCs内SM-α-actin的mRNA及蛋白表达水平明显降低;同时PKGIa的mRNA以及蛋白表达表达逐渐降低。结论PKGIa可能在低氧致人PASMCs表型改变中有重要的调控作用。
- 易斌陆俊羽钱桂生白莉王关嵩赵艳
- 关键词：肺动脉平滑肌细胞细胞表型
- 膜联蛋白A1在低氧诱发人肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用被引量：1
- 2011年
- 目的评价膜联蛋白A1（ANXA1）在低氧诱发人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖中的作用。方法采用随机数字表法，将培养的人PASMCs随机分为5组（n=60）：常氧组（N组）和低氧2、8、12和24h组（H1组-H5组）。N组用21％0：处理24h，H1组～H4组用3％02分别处理2、8、12、24h。各组处理结束时分别用RT-PCR和Westemblot检测人PASMCs ANXA1mRNA及其蛋白的表达水平，采用甲基噻唑基四唑法和氚．胸腺嘧啶核苷掺入法检测PASMCs的增殖情况。结果与N组比较，H1组～H4组人PASMCsANXA1mRNA及其蛋白表达下调，增殖增强（P〈0．05）；H1组-H4组人PASMCsANXA1mRNA及其蛋白表达逐渐下调，增殖逐渐增强（P〈0．05）。结论低氧诱发人PASMCs增殖时ANXA1表达下调，该变化可能是低氧诱导人PASMCs增殖的机制之一。
- 曾静易斌王芝国斌鲁开智王晓斌
- 关键词：膜联蛋白A1细胞低氧肌细胞平滑肌肺动脉细胞增殖
- 低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞中PTEN／Akt1表达的变化与细胞增殖的关系被引量：7
- 2008年
- 目的通过观察低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）与细胞张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶（PTEN）和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶1（Akt1）mRNA及其蛋白表达水平的变化与低氧PASMC增殖的关系，探讨PTEN／Akt1信号途径在低氧肺血管重建中的可能调控作用。方法用组织块法培养PASMC。采用半定量逆转录-PCR技术检测常氧组、低氧2、8、12、24h组PTEN、Akt1基因mRNA的表达水平，采用Western blot技术检测相应的蛋白表达水平。采用噻唑蓝比色法和氚-胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H—TdR）掺入法检测PASMC的增殖改变。数据用x±s表示，采用Excd 2003软件进行t检验，P〈0．05为差异有统计学意义。结果低氧刺激PASMC不断增殖，^3H-TdR法检测的吸光度值低氧12h组（0．70±0．10）比常氧组（0．37±0．06）明显增高（t=14．29，P〈0．01）；噻唑蓝法检测的吸光度值低氧24h组（11208±679）比常氧组（8374±545）明显增高（t=19．56，P〈0．01）。各组均检测出PTEN、Akt1基因mRNA及蛋白表达的变化。常氧组Akt1的mRNA、总蛋白、磷酸化蛋白的吸光度值分别为0．76±0．09、25±6和48±8，随着低氧培养时间延长，吸光度值逐渐升高，低氧8h组达到高峰，分别为1．05±0．09、41±7和79±14，与常氧组比较，差异均有统计学意义（t值为8．31—168．00，P〈0．05和P〈0．01），随后开始下降，低氧24h组恢复至常氧组水平。常氧组PTEN的mRNA、磷酸化蛋白的吸光度值分别为0．25±0．06和98±8，并随着低氧培养时间延长而逐渐升高，低氧24h组达到高峰，分别为0．38±0．05和232±12，与常氧组比较，差异均有统计学意义（t值分别为22．04和50．46，均P〈0．01）。结论PTEN／Akt1的转录和激活与低氧肺血管重建的PASMC增殖密切相关。
- 易斌钱桂生白莉王关嵩
- 关键词：蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶
- 肝肺综合征大鼠肺微血管内皮细胞肌样分化时转化生长因子β1表达的变化被引量：5
- 2011年
- 目的评价肝肺综合征（HPS）大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）肌样分化时转化生长因子β1（TGF-β1）表达的变化。方法健康SD大鼠40只，雌雄不拘，3～4月龄。采用随机数字表法，随机取20只大鼠，采用慢性胆总管结扎法制备HPS模型，剩余大鼠行假手术，取腹主动脉血样4ml，离心后取血清。另取健康成年SD大鼠10只，原代培养、纯化及鉴定PMVECs。PMVECs接种于低糖DMEM培养基（10^6个／cm2），采用随机数字表法，将细胞随机分为2组：对照组（C组）和HPS组，每组24皿。C组给予正常大鼠血清，HPS组加入HPS大鼠血清，血清终浓度为10％。于细胞孵育24h（T1）、48h（T2）和72h（T1）时分别采用RT-PCR法和Westernblot法测定PMVECs内平滑肌肌球蛋白重链（SM—MHC）、平滑肌肌动蛋白a（SM-α-actin）、肌钙蛋白、TGF-β1 mRNA及其蛋白的表达。结果C组PMVECs内SM-α-actin、肌钙蛋白表达阴性，可见少量SM．MHC表达，HPS组PMVECs内SM-MHC、SM-α—actin、肌钙蛋白表达阳性。与C组比较，HPS组SM—MHC、TGF-β1mRNA及其蛋白的表达上调（P〈0．05）；与T1时比较，T2，3时HPS组SM-MHC、SM-α-actin、肌钙蛋白、TGF—p1mRNA及其蛋白的表达上调（P〈0．05）；与T2时比较，L时HPS组SM-MHC、SM-α-actin、肌钙蛋白、TGF-β1mRNA及其蛋白的表达上调（P〈0．05）。结论TGF-β1在HPS大鼠PMVECs肌样分化时可能起到重要的调控作用。
- 王芝易斌国斌鲁开智
- 关键词：肝肺综合征内皮细胞转化生长因子Β1细胞分化
- 野生型蛋白激酶GIα腺病毒抑制低氧肺动脉平滑肌细胞表型转换及细胞增殖被引量：4
- 2010年
- 目的 观察携带野生型蛋白激酶GIα腺病毒（Ad-PKGIα）抑制低氧诱导人肺动脉平滑肌细胞（PASMC）表型转换及其增殖的影响,探讨其在低氧肺血管重建（HPVR）中的作用.方法 组织块法建立人PASMC细胞系.Ad-PKGIα转染PASMC;采用荧光显微镜观察转染效率;RT-PCR、Western blot检测PASMC中PKGIα mRNA表达、Ad-PKGIα转染对低氧PASMC表型转换中平滑肌α肌动蛋白（SM-α-actin）表达的影响.流式细胞仪检测Ad-PKGIα转染后低氧对PASMC细胞周期的影响;~3H-TdR掺入法检测PASMC增殖.结果 （1）Ad-PKGIα转染后PASMC中PKGIα mRNA水平、磷酸化PKGIα蛋白水平显著增高.（2）常氧时PASMC中SM-α-actin蛋白表达为44.25±5.34;3% O_2处理12 h PASMC中SM-α-actin蛋白表达水平降至32.18±4.19,处理24 h SM-α-actin蛋白表达水平降至21.90±2.44.（3）低氧条件下,PASMC开始增殖,随着低氧时间延长,PASMC增殖逐渐增加,至24 h PASMC增殖最多[（14 924±1491）次/min].与未转染对照组、腺病毒空载体组比较,Ad-PKGIα转染组PASMC增殖明显受到抑制.（4）低氧使未转染对照组和腺病毒空载体组的PASMC进入有丝分裂期,随着低氧时间延长,G0/G1期细胞比例逐渐减少,S＋G_2/M期细胞比例逐渐增加.Ad-PKGIα转染后常氧状态下PASMC G0/G1期细胞比例下降、S＋G2/M期细胞比例上升趋势均明显减缓.结论 PKGIα基因在低氧肺血管重建信号转导途径中有重要的调节作用,可作为基因治疗的靶点之一.
- 易斌陆俊羽白莉王关嵩钱桂生
- 关键词：蛋白激酶类腺病毒科
- 携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定被引量：5
- 2009年
- 目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack-PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增。检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度。结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因。构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液。结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体。
- 易斌陆俊羽白莉王关嵩钱桂生
- 关键词：腺病毒载体基因克隆DNA重组
- 肝肺综合征大鼠血清对肺微血管内皮细胞Akt表达的影响被引量：9
- 2010年
- 目的探讨肝肺综合征（HPS）大鼠血清对肺微血管内皮细胞（PMVECs）丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）表达的影响。方法健康3～4月龄SD大鼠30只，雌雄不拘，采用慢性胆管结扎法制备HPS模型。另取正常大鼠，原代培养、纯化及鉴定PMVECs。PMVECs接种于低糖DMEM培养基（106，cm^2）或96孔培养板（200μl/孔），随机分为2组：对照组（C组）和HPS组，每组24皿或90孔，C组不予处理，HPS组加入HPS大鼠血清，血清终浓度为10％。于HPS大鼠血清中孵育24、48和72h（T1-3）时分别采用RT-PCR法和Western blot法检测Akt。mRNA、A地mRNA和AkhmRNA及其蛋白的表达，采用MTY法和^3H-Tdn掺人法检测PMVECs增殖情况。结果与c组比较，HPS组PMVECs增殖增强，Akt蛋白及其mRNA表达水平上调（P〈0．05）；与L时比较，T2．3时HPS组PMVECs增殖增强，Akt蛋白及其mRNA表达水平上调（P〈0．05）；与T2时比较，T3时HPS组PMVECs增殖增强，Akt蛋白及其mRNA表达水平上调（P〈0．05）。结论Akt可能参与了HPS大鼠PMVECs增殖的调节。
- 国斌易斌徐顺贵鲁开智
- 关键词：内皮细胞蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶肝肺综合征
