国家教育部博士点基金(20040226011)
- 作品数：8 被引量：12H指数：2
- 相关作者：张凤民车彦军林志国刘利沈红更多>>
- 相关机构：哈尔滨医科大学更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金黑龙江省杰出青年科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 重组腺相关病毒对大鼠神经干细胞的体外转染及其对细胞生长的影响被引量：2
- 2007年
- 目的 研究重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体对原代培养的神经干细胞（neural stemcells，Nsc）的体外转染及其对细胞增殖、分化和迁移能力的影响。方法 取新生24h内的Wistar大鼠的海马进行神经干细胞原代培养，用不同滴度的rAAV为载体，以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因作为报告基因进行体外转染NSC，通过观察有绿色荧光的NSC的数量，测定rAAV对NSC的体外转染情况；用MTT法测定不同病毒滴度下rAAV对NSC增殖能力的影响，用免疫组化法鉴定NSC、神经元及神经胶质细胞，并在倒置荧光显微镜下直接测定细胞的迁移距离。结果 rAAV对NSC的体外转染效率随着病毒滴度的增加而提高，在转染后的第11天表达水平最高，用MOI为10^4、10^5、10^6的rAAV转染后第11天的转导率分别是9．81％、56．30％、64．67％；不同滴度rAAV转染NSC后不同时间点的MTT测定A值随着病毒滴度的增加而明显减小，差异均有统计学意义；但不同滴度rAAV转染NSC，其分化为神经元和神经胶质细胞的比率以及迁移的距离未见差异。结论 较高滴度（MOI为10^5和10^6）的rAAV可以在体外有效地转染神经干细胞，且不影响神经干细胞的分化和迁移能力，但对其增殖能力有明显抑制，并表现为病毒滴度依赖性。
- 车彦军林志国沈红宋武奇刘利李晓波张凤民
- 关键词：腺相关病毒绿色荧光蛋白神经干细胞转染
- 体外癫痫神经元细胞膜显微结构的研究
- 2007年
- 目的利用原子力显微镜观察体外癫痫神经元细胞膜显微结构。方法将培养14d的神经元放入“无镁”细胞外液处理3h后,再重新放回含镁的正常细胞外液培养,利用膜片钳记录神经元的自发性电活动。将“无镁”细胞外液处理3h的神经元定为实验组,将未经“无镁”外液处理的神经元定为对照组。分别在80μm×80μm,2μm×2μm和500nm×500nm扫描范围,对两组神经元细胞膜表面进行扫描,同时测量两组神经元表面相关结构的直径和深度。结果膜片钳提示“无镁”细胞外液处理3h和恢复正常外液14d时,神经元存在自发的癫痫样放电。在扫描范围为80μm×80μm时,两组神经元细胞膜表面光滑;在2μm×2μm时,两组神经元细胞膜表面出现一些小凹;在500nm×500nm时,实验组神经元表面小凹的直径和深度分别为(114.86±9.33)nm和(5.71±0.69)nm,对照组为(116.4±9.13)nm和(5.69±0.71)nm,两组相比无显著性差异(P>0.05)。结论原子力显微镜是进行细胞膜显微结构观察的良好工具;“无镁”外液处理神经元3h,神经元细胞膜显微结构未发生改变。
- 沈红王景贺刘利林志国车彦军张帆张凤民白云龙杨富明
- 关键词：原子力显微镜
- 腺相关病毒-2介导增强型绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究被引量：1
- 2005年
- 目的探讨血清2型腺相关病毒(rAAV2)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染神经干细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达规律及转染对神经干细胞生物学特性的影响。方法应用荧光显微镜观察转染神经干细胞的绿色荧光蛋白表达情况。传代后第10天,比较转染组和对照组子代细胞形成的神经球数;分化后第14天行免疫组织化学检查,比较转染组和对照组神经元和胶质细胞的比例。结果转染后第3天,可观察到神经球发出绿色荧光,强度逐渐增强,并在第9天达到稳定状态(90%的神经球发出强弱不等的荧光)。传代后第10天,转染组子代细胞每井形成的神经球数为(17.83±1.35)个,与对照组比较无显著性差别(P>0.05)。分化后第14天,转染组神经元、胶质细胞的胞体与纤细突起均可见绿色荧光,转染组神经元与胶质细胞比例分别为35.3%±3.1%和55.4%±7.3%,与对照组比较无显著性差别(P>0.05)。结论rAAV2-EGFP可以稳定、高效转染神经干细胞,且不影响神经干细胞的生物学特性,是神经干细胞理想的基因标记方法。
- 刘利林志国沈红车彦军宋武琦张凤民杨富明
- 关键词：依赖病毒绿色荧光蛋白质类干细胞转染
- 博尔纳病病毒p40基因重组质粒的构建及鉴定被引量：1
- 2007年
- 目的构建博尔纳病病毒p40基因重组表达质粒。方法通过PCR方法扩增获得博尔纳病病毒p40基因的完整序列,将此片段定向克隆到pEGFP-N1载体多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性。结果成功构建博尔纳病病毒p40基因重组表达质粒。结论本文构建的重组质粒将为研究博尔纳病病毒p40基因在真核细胞中的功能和作用提供实验依据。
- 车洋答嵘宋武琦李小光钱钧翟爱霞陈小贝张凤民
- 关键词：博尔纳病病毒基因重组PCR
- 神经干细胞移植于慢性癫痫鼠海马CA3区对其认知功能的影响被引量：3
- 2007年
- 目的探讨神经于细胞(NSCs)移植到慢性海人酸(KA)致癫痫鼠海马CA3区后对其认知功能的影响。方法采用KA脑室注射法制作慢性癫痫鼠模型,将原代培养的增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记的NSCs移植到慢性癫痫鼠的海马CA3区,所有大鼠在移植组移植后12周行Morris水迷宫试验,然后移植组大鼠取脑冰冻切片,在倒置荧光显微镜下直接观察移植细胞的存活和迁移,采用免疫荧光染色法观察移植细胞分化情况。结果癫痫鼠组大鼠在目标区域逗留时间明显短于正常大鼠组,而逃避潜伏期明显长于正常大鼠组(P<0.01);移植组大鼠的逃避潜伏期比癫痫组和假手术组大鼠明显缩短,在目标区域逗留时间显著延长(P<0.01)。且移植后12周,NSCs大量存活(65045.00±881.72),迁移到齿状回和海马各区并分化为神经元和神经胶质细胞。结论癫痫能够损害大鼠的认知功能。将NSCs移植于KA致慢性癫痫鼠海马CA3区后,NSCs不仅能够长期存活、迁移到齿状回和海马各区并分化成神经元和神经胶质细胞,而且能够明显改善癫痫鼠的认知能力。
- 林志国车彦军沈红刘利张凤民马晓燕杨富明
- 关键词：神经干细胞海马癫痫
- 博尔纳病病毒接种Wistar大鼠脑组织中病毒基因组的原位检测
- 2009年
- 本文旨在用原位杂交法探讨博尔纳病病毒(BDV)接种Wistar大鼠脑组织中BDV基因组的分布情况。DIG RNA labeling kit标记BDV p24正链探针后,用斑点实验检测该探针的标记效率,斑点杂交法检测该探针的特异性。在其标记效率与特异性均达到实验要求后,用该探针对颅内接种BDV(H1766株)的Wistar大鼠脑组织中BDV基因组进行原位杂交检测。结果发现,接种3周后,BDV感染主要发生在皮质和海马,仅少量发生在丘脑和下丘脑;接种6周后,皮质和海马的BDV感染仍然存在,且丘脑和下丘脑的BDV感染明显增强,说明BDV在大鼠脑组织中的分布范围随着感染时间的延长而逐步扩大。本文建立的原位杂交法可用于检测BDV在Wistar大鼠脑组织内的分布与迁移情况。
- 刘爱平李玉军李小光宋武琦李爱梅周淑如张凤民
- 关键词：博尔纳病病毒原位杂交斑点杂交
- 博尔纳病病毒感染的非免疫病理性致病机制的研究进展被引量：2
- 2006年
- 答嵘陈小贝宋武琦李小光张凤民
- 关键词：博尔纳病病毒神经营养因子分子模拟神经可塑性
- 体外癫癎微环境下神经干细胞发育的初步研究被引量：3
- 2006年
- 目的探讨神经干细胞在癫癎微环境下能否发育为"癫癎神经元"。方法"无镁"外液处理神经元建立"癫癎神经元"模型。将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞分别与正常海马神经元、"癫癎神经元"共培养,应用膜片钳记录干细胞的突触后电位,利用免疫荧光检测干细胞突触素抗体染色情况。将神经干细胞分化神经元放入"无镁"外液,应用膜片钳记录其突触后电位。结果在"无镁"细胞外液处理3h 后恢复正常细胞外液培养14d,神经元仍存在自发的"癫癎样放电"。干细胞与"癫癎神经元"共培养时,免疫荧光结果示80%干细胞突触素染色阳性,膜片钳记录到干细胞12次/5min 兴奋性突触后电位。在"无镁"外液中,60%干细胞分化神经元出现14次/5min 时程约10s的兴奋性突触后电位,未记录到"癫癎样放电"。结论干细胞能够与周围神经元形成功能性突触;干细胞在癫癎微环境下转变成"癫癎神经元"的可能性极小。
- 林志国刘利沈红车彦军张帆白云龙张凤民杨富明
- 关键词：干细胞癫痫神经元细胞分化
