国家自然科学基金(20802027)
- 作品数：14 被引量：41H指数：4
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- PCR依赖型方法构建高质量酵母基因突变文库被引量：2
- 2011年
- 针对定向进化中利用亚克隆的方法建立酵母突变文库建库周期长、效率低、库容量低、丰度低等问题,建立了一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的新方法。步骤为：构建目标基因的重组表达质粒;以此为模版,设计长引物片段,PCR/易错PCR/DNA Shuffling等方法扩增得到两端带有与表达载体40~70 bp同源序列的突变基因;再利用PCR扩增得到表达载体;将扩增得到的目标基因和表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母,目标基因和表达载体在酵母体内同源重组成为完整的表达盒,整合入酵母基因组,获得基因突变文库。对构建的突变文库进行筛选,分别得到了酶活、蛋白表达量及热稳定性提高的突变株。该方法为完全PCR依赖型（PDM）,在体内构建表达盒,效率高,操作方便,将建库周期由2周缩短为3 d,将库容量从传统的103~104提高到105以上,库阳性率达到95%。
- 王睿喻晓蔚徐岩郅岩孔宇
- 关键词：同源重组毕赤酵母
- D190V点突变提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCCM 201021脂肪酶的最适温度和热稳定性被引量：6
- 2013年
- 【目的】对来源于Rhizopus chinensis CCTCC M201021的脂肪酶进行了D190V定点突变,提高该酶的最适温度和热稳定性。【方法】对毕赤酵母表达的突变酶D190V与野生型酶r27RCL进行酶学性质比较。【结果】D190V的最适温度比r27RCL高5°C,65°C下的半衰期提高了一倍,在其他性质方面,突变酶D190V与r27RCL基本相似。【结论】通过结构分析表明,定点突变D190V提高该酶稳定性的主要原因可能在于提高了突变位点所在的α螺旋的稳定性以及增强了稳定蛋白质结构的氢键作用力。
- 吴厚军喻晓蔚沙冲徐岩
- 关键词：定点突变最适温度热稳定性
- 非水相中微生物脂肪酶催化转酯化拆分(R,S)-α-苯乙醇被引量：4
- 2011年
- 研究了非水有机溶剂体系中脂肪酶不对称转酯化拆分(R,S)-α-苯乙醇反应,比较了15种不同微生物来源的脂肪酶,从中优选出催化活性及对映选择性较高的脂肪酶LipasePS,系统考察了影响该酶催化不对称转酯化反应的关键因素,获得了优化的催化拆分工艺条件.结果表明,脂肪酶LipasePS在非水反应体系中,以正己烷为反应介质,初始水活度为0.75,底物苯乙醇和乙酸乙烯酯浓度分别为0.3和0.6mol/L,加酶量5mg/ml,35°C,200r/min,反应14h后,底物(R,S)-α-苯乙醇的转化率达44.7%,产物(R)-乙酸苯乙酯的光学纯度达98.6%.水活度可影响酶对底物的转化率和对映选择性.
- 秦丽娜喻晓蔚徐岩
- 关键词：脂肪酶转酯化对映选择性
- NH_4^+离子对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶发酵过程的影响被引量：2
- 2016年
- 利用重组毕赤酵母在7 L的发酵罐中进行分批补料高密度发酵,考察不同NH4+质量浓度对毕赤酵母基因工程菌表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,补加(NH4)2SO4溶液维持NH4+质量浓度在7 g/L时华根霉脂肪酶酶活最高,分别是不补加(NH4)2SO4溶液、补加并维持NH4+质量浓度在5 g/L、10 g/L条件下的1.41、1.11、1.08倍,而且在该氮源质量浓度条件下,胞外总蛋白质质量浓度最高,达到5.61 g/L。通过分析不同氮源条件下发酵参数比生长速率、产物比形成速率和底物比消耗速率的差异,发现发酵维持NH4+质量浓度在7 g/L时,产物比形成速率和底物比消耗速率均较高,这与该条件下产酶水平最高相一致。研究结果表明,对毕赤酵母基因工程菌发酵过程中的氮源进行优化,能够明显促进外源蛋白质的表达。
- 赵林水喻晓蔚徐岩
- 关键词：毕赤酵母高密度发酵
- 基因拷贝数和甲醇浓度对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶的影响被引量：8
- 2011年
- 将华根霉脂肪酶基因克隆到甲基营养型毕赤酵母中表达,以甲醇利用快型菌株为宿主,在7 L发酵罐水平对脂肪酶基因拷贝数分别为3、5、6的3株基因重组菌——XY RCL-3、XY RCL-5、XY RCL-6进行高密度发酵调控,同时研究了甲醇浓度对表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,XY RCL-5在相同条件下发酵产酶能力高于XY RCL-6和XY RCL-3,最适甲醇诱导浓度控制在0.1%±0.02%时,酶活可达到12 500 U/mL,菌体干重达到204 g/L,蛋白浓度也能达到8.02 g/L。
- 李飞喻晓蔚沙冲徐岩
- 关键词：基因拷贝数毕赤酵母
- BMMYA'平板-Fast blue RR顶层琼脂法高效筛选高酶活脂肪酶
- 2012年
- 摘建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶菌株的平板方法。该方法以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA'平板-FastblueRR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛菌株接种至含有2%甲醇的BMMYA'平板上,30℃生长并诱导4～5 d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1 h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顶层琼脂。2 min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株。该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90%。
- 王睿喻晓蔚沙冲徐岩
- 关键词：FASTBLUE高温处理
- 定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力被引量：15
- 2009年
- 运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。
- 王睿喻晓蔚沙冲徐岩
- 关键词：定向进化易错PCR
- 米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶基因ProROL在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达
- 2013年
- 米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在食品和油脂加工等方面具有广泛的应用前景。本研究通过PCR技术获得了米根霉脂肪酶前肽基因序列与成熟肽基因序列(ProROL),并将该基因克隆到表达载体pPIC9K上。线性化表达质粒后电转化感受态毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)GS115,通过筛选得到了阳性重组菌。摇瓶及7 L罐发酵结果显示,以p-NPP为底物,上清胞外酶活分别为10.6 U/mL和126.8 U/mL。酶学性质研究发现,该酶的最适温度为40℃左右,在低于40℃条件下,保温30 min后,能够保存60%以上的酶活力;其最适pH为8.5左右,在pH 6.0-10.0范围内保持1 h后,均能保留60%以上的酶活力。本研究构建的基因重组菌株将为该酶的工业化生产与应用提供一定的理论基础。
- 郭勇亮喻晓蔚徐岩
- 关键词：毕赤酵母
- 重组毕赤酵母表达华根霉脂肪酶发酵液的絮凝除菌条件研究
- 2011年
- 在重组毕赤酵母表达华根霉脂肪酶的研究中,目的蛋白的提取收率是关键。由于产物脂肪酶是分泌在发酵液中,常用的方法是加入絮凝剂使菌体沉淀,再通过离心获取上清液中的目的蛋白。本研究改良了传统的絮凝剂配方,确定了絮凝剂的新配方:发酵液中加入2%的氯化钙以及磷酸氢二钠按摩尔比1:1混合液,500 mg/L聚丙烯酰胺,同时调节发酵液pH为6.0。结果表明,优化后的絮凝条件能有效的除菌并降低酶活损失。
- 李飞喻晓蔚徐岩
- 关键词：絮凝聚丙烯酰胺碱式氯化铝PH
- 诱导温度调控华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶的表达及稳定性研究被引量：3
- 2010年
- 比较了7 L发酵罐中不同诱导温度对华根霉前导肽脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达水平和稳定性的影响。通过实验表明在28℃条件下,最大酶活可以达到1412.5 U/mL,是30℃条件下的2.3倍,25℃条件下的1.3倍;而其产率可以达到12811 U/L·h^(-1),比产率达到82.6 U/g_(DCW)·h^(-1)。同时,在实验过程中发现诱导温度对目的蛋白的降解和聚合有重要的影响。通过对蛋白酶活性的测定和还原SDS-PAGE证实随着诱导温度的提高,蛋白酶活性急剧上升,从而导致由前导肽(37 kD)降解为成熟肽(30 kD)的降解作用的加剧。此现象在30℃条件下最为明显,在诱导84 h时前导肽已经全部降解为成熟肽。另外,通过非还原SDS-PAGE和分析表明随着诱导温度的提高也导致了二聚体的含量也逐渐增加。
- 王同春喻晓蔚徐岩
- 关键词：毕赤酵母
